彗星實驗方法的優化及影響因素的分析

范南英,張 鵬

彗星實驗是一種基于凝膠電泳的方法,可在單細胞水平上測量DNA損傷。目前,彗星實驗根據裂解液pH的高低可以分為堿性彗星實驗[1]和中性彗星實驗[2]。堿性彗星實驗靈敏度較高,廣泛用于DNA單鏈、雙鏈斷裂或堿不穩定位點的檢測。影響彗星實驗結果的因素比較多,如瓊脂糖濃度、細胞密度、電壓以及其他未知原因[3-5],因此實驗中選擇合適的陽性對照對于彗星實驗結果可信度非常重要。過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)是一種強氧化劑,將細胞暴露于H2O2會導致細胞DNA發生損傷[6]。有研究[7-8]通過400 μmol/L H2O2處理構建人肝癌細胞(HepG2)的損傷模型。另有研究[9-12]選用1 mmol/L H2O2處理的心肌細胞(H9c2細胞)構建損傷模型。不同細胞對H2O2的敏感性不同,因此,構建細胞損傷模型時應根據細胞類型來確定H2O2濃度。目前,體外損傷模型的建立主要集中在肝細胞或心肌細胞。對于白血病細胞HL-60損傷模型構建的研究很少。因此,該研究以H2O2為DNA損傷誘導劑,探討影響彗星實驗結果的可能因素,分析各種影響因素對彗星實驗結果的可能原因,為穩定可靠的彗星實驗提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料IMDM基礎培養基、細胞培養用血清(fetal bovine serum, FBS)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)、100 000 U/L青鏈霉素均來自美國Gibco公司;6孔板和T25培養瓶購自康寧Corning公司;HL-60細胞為本實驗室保存。30% H2O2來自重慶川東化工有限公司;NaOH來自天津科密歐公司;Na2EDTA、正常熔點瓊脂糖來自北京索萊寶科技有限公司;月桂酰基氨酸鈉、氯化鈉、低熔點瓊脂糖均來自德國Sigma;磨砂載玻片來自廣州帆船;黏附載玻片和蓋玻片來自江蘇世泰。

1.2 方法

1.2.1HL-60細胞培養 HL-60細胞培養于T25的細胞培養瓶,并使用IMDM完全培養基進行培養,完全培養基組成包括20% FBS、1%青鏈霉素;每天觀察細胞生長情況,每隔1 d進行1次半量換液,細胞生長密度約90%時進行傳代培養。

1.2.2制膠方法的優化 傳統的制膠流程為：向載玻片上滴加100 μl正常熔點瓊脂糖,加蓋蓋玻片壓平,4 ℃、10 min后,取下蓋玻片,獲得底層膠;在底膠上加入混有細胞的低熔點瓊脂糖,并用蓋玻片壓平,4 ℃、10 min后,取下蓋玻片,獲得第二層膠。最后根據制備底膠的方式制備第三層膠,形成類似“三明治”式的膠層結構。Ostling et al[1]的制膠方法需要3個步驟,制備的膠層較厚,在后續實驗中容易脫膠。因此,本研究對該方法進行了優化,將制膠步驟由3步改為2步,具體優化步驟如下。

① 底層膠的制備：傳統方法需要向載玻片上滴加100 μl正常熔點瓊脂糖,加蓋蓋玻片(壓片法);優化方法為用鍍膜法制備底膠,將潔凈預熱的磨砂載玻片垂直放置于盛有正常熔點瓊脂糖溶液的燒杯中約1 min,然后水平放置于4 ℃的載玻片架上5 min。對不同濃度的正常熔點瓊脂糖(0.8%、1%)進行篩選,觀察后續實驗中是否有脫膠。② 包埋細胞膠層的制備：將細胞懸液與低熔點瓊脂糖凝膠混合(37 ℃),滴加100 μl于底層膠上,蓋上載玻片,4 ℃、10 min。對不同濃度的低熔點瓊脂糖(0.5%、0.7%、1%)進行篩選,觀察后續操作中是否有脫膠。

1.2.3瓊脂糖溶劑的篩選 稱取相應克重的瓊脂糖,加入超純水和PBS通過微波爐溶解。

1.2.4膠層中細胞密度的篩選 收集生長狀態良好的HL-60細胞,用PBS調整細胞密度為2×105和6×104個/ml,將細胞懸液與低熔點瓊脂糖溶液按1 ∶3的體積比混勻,取100 μl細胞-瓊脂糖混合物轉移到適當的正常熔點瓊脂糖包被的磨砂載玻片上。立即加蓋蓋玻片,注意使載玻片盡可能保持水平,4 ℃、15 min。染色后通過熒光顯微鏡觀察凝膠中細胞密度。

1.2.5堿性裂解時間的優化 將包埋有細胞的載玻片置于染色缸中,加上堿性裂解液,4 ℃下避光、裂解。對不同裂解時間(1 h、過夜裂解)進行篩選,觀察細胞在瓊脂糖層中的拖尾情況。

1.2.6陽性對照實驗H2O2濃度的篩選 H2O2處理HL-60細胞20 min,對不同H2O2作用濃度(0.1%、0.01%、0.001%、0.000 1%)進行篩選。

2 結果

2.1 制膠方法的優化本研究對傳統制膠法進行了優化,即只包含底膠和含細胞膠層。制備底膠時,采用鍍膜法,制備包埋細胞膠層時采用壓片法。實驗結果顯示,鍍膜法制備的底膠表面光滑,可以解決脫膠問題,且易于學習和操作,在后續實驗中沒有發生脫膠。使用濃度為0.8%和1%的正常熔點瓊脂糖進行鍍膜時,濃度為0.8%的正常熔點瓊脂糖制膠效果佳。凝膠能較好的吸附于載玻片上,膠面光滑,在后續實驗中凝膠沒有發生脫落。根據實驗結果,選擇0.8%正常熔點瓊脂糖溶液制備底膠。結果顯示,采用濃度為0.5%、0.7%和1%的低熔點瓊脂糖包埋細胞時,0.7%包埋效果最好。此時凝膠與正常熔點瓊脂糖膜的黏附性較好,在后續實驗中凝膠沒有發生脫落(制片操作流程見圖1)。

圖1 彗星實驗制片流程

2.2 瓊脂糖溶劑的選擇將未經H2O2誘導的HL-60細胞包埋在低熔點瓊脂糖中進行實驗,結果顯示,當瓊脂糖溶劑為超純水時,HL-60細胞出現拖尾(圖2A)。當瓊脂糖溶劑為PBS時,HL-60細胞沒有拖尾(圖2B)。

圖2 瓊脂糖溶劑對彗星實驗結果的影響 ×20

2.3 合適細胞密度的選擇在熒光顯微鏡下觀察未經H2O2誘導的HL-60細胞電泳結果。結果顯示,當凝膠中細胞密度為2×105個/ml時,視野中細胞數量較多(圖3A),視野內細胞過于密集,不利于圖像分析。當凝膠中細胞密度為6×104個/ml時,可觀察到適量細胞,約為7個(圖3B),視野中細胞數量適宜圖像分析,選擇6×104個/ml作為凝膠中的細胞密度。

圖3 不同細胞量在視野中的顯示情況 ×20

2.4 細胞裂解時間的優化將未經H2O2誘導的HL-60細胞包埋在低熔點瓊脂糖中進行實驗,結果顯示,過夜裂解細胞,HL-60細胞DNA存在拖尾(圖4A)。裂解時間為1 h,HL-60細胞DNA在電泳中沒有拖尾(圖4B)。

圖4 裂解時間對彗星實驗的影響 ×20

2.5 電泳電壓的優化結果顯示,電壓為0.6 V/cm時,0.001% H2O2處理HL-60細胞DNA在電泳中形成刺猬狀。電壓為1 V/cm時,此時DNA在電泳中形成的彗星尾清晰,容易判讀。電壓為1.5 V/cm時,DNA在電泳中形成的彗星尾清晰度較差,不易判讀。電壓為1.75 V/cm時,DNA在電泳中形成的彗星尾和彗星頭部已經分離。見圖5。

圖5 不同電壓大小對彗星實驗的影響 ×20

2.6 陽性對照實驗的篩選本研究通過優化后的彗星實驗檢測不同濃度的H2O2(0.1%、0.01%、0.001%、0.000 1%)處理的HL-60細胞DNA損傷情況,驗證優化后的實驗體系是否可靠,并建立DNA損傷模型。結果顯示,0.1%、0.01%和0.001% H2O2處理細胞DNA都出現拖尾,但0.1%和0.01% H2O2處理組DNA拖尾較大,彗星頭和彗星尾已分離,不易判讀。0.000 1% H2O2處理組細胞在電泳中形成刺猬狀,不易觀察。見圖6。

圖6 不同濃度H2O2對HL-60 DNA損傷影響 ×20

3 討論

彗星實驗是一種靈敏、快速的實驗方法,用于檢測真核生物單個細胞中DNA雙鏈和單鏈斷裂以及堿不穩定位點[3]。近年來,該方法已廣泛應用于遺傳毒理學、環境生物監測和細胞凋亡等研究[4-5]。本研究探討了影響彗星實驗結果的可能因素,為穩定可靠的彗星實驗提供理論依據。

傳統彗星實驗存在操作復雜,膠面不光滑和易脫膠等問題[13]。底膠不均勻和脫膠的原因主要是制備底膠時采用壓片法,需要將蓋玻片揭去。本研究采用鍍膜法制備底膠克服了膠體不均勻和脫膠的問題。實驗表明,包埋膠層的脫膠主要與低熔點瓊脂糖的濃度和涂膠方式有關。若采用“三明治”法制膠,每一層膠凝固后都需移去蓋玻片,極易導致脫膠。經優化后,以0.7%低熔點瓊脂糖作為包埋層,采用“壓片法”將其展開,這種“雙層凝膠法”操作簡便,較好地解決了脫膠問題。在制膠過程中確保細胞完整性也是實驗成功的關鍵點,當溶劑為超純水時,未經處理的HL-60細胞出現拖尾。超純水促使細胞膜破裂,暴露的DNA與凝膠中存在的水和氧自由基(ROS,reactive oxygen species)進行水解和氧化反應,從而導致DNA損傷[14]。以PBS為溶劑,它能較好維持細胞結構和生理完整性,有助于細胞保持在其生理pH范圍內,并在短期內保持細胞高活力[15]。

細胞密度也會影響彗星實驗結果的判讀[4],最佳的細胞密度是決定實驗成敗的關鍵因素。一個視野內的細胞數量應盡可能多,同時又不重疊,這樣圖像的獲取快速又方便。結果表明,當細胞密度為6×104個/ml時,視野中約有7個細胞,細胞分布較好,適合凝膠中的細胞密度。同時,細胞密度也需要根據待測細胞的類型來確定[4]。當細胞DNA損傷嚴重時,彗星拖尾較長,應適當降低細胞密度。當細胞DNA損傷較輕時,可適當增加細胞密度。

由于電泳電壓和裂解時間會對彗星實驗結果產生影響,因此,每次實驗的電泳條件應保持一致,以避免因電泳條件不同而出現“假陽性”結果。本實驗中,電壓為1 V/cm,電流為25 mA,電泳時間為25 min可以將損傷的DNA泳出。若電壓太小,斷裂DNA不能被泳出;電壓太大,則形成的彗尾較大,不利于圖像分析。因此,選擇1 V/cm電壓作為該實驗的電泳電壓。

由于彗星實驗結果的影響因素繁多,因此在實驗中需要設置對照來確保實驗設計的合理性、實驗結果的可靠性和有效性。H2O2進入細胞會產生氧自由基從而造成細胞的DNA損傷,本研究采用H2O2作為DNA損傷劑誘導HL-60細胞以建立陽性對照。實驗顯示,0.001% H2O2誘導HL-60形成的損傷圖像清晰,彗星頭清晰,彗尾長度適中,結果容易判讀,根據實驗結果,選擇0.001% H2O2誘導作為該實驗的陽性模型。高濃度H2O2(0.1% H2O2和0.01% H2O2) 誘導HL-60形成的損傷較嚴重,彗星頭很小,結果不容易判讀。同時低濃度H2O2(0.000 1%) 誘導HL-60形成的圖像為刺猬狀,不容易產生彗星。因此,在實際彗星實驗中要針對不同細胞選擇合適的H2O2作為陽性處理。

綜上所述,彗星實驗作為檢測DNA損傷的經典方法,結果會受到多方面的因素影響,這些影響因素可能出現的原因及解決的方法如表1所示。在實驗過程中通過實驗流程的優化和陽性對照實驗的建立才能保證準確有效彗星實驗結果。

表1 彗星實驗障礙及解決方法