大麻素2型受體在加速正畸牙移動中的作用

范登瑩,翟浩嫣,劉慧娟,趙 圓,李東娜,喬 星,康文靜,朱德超,劉春艷

亞洲人錯合畸形發病率高達48%[1],目前臨床上正畸療程長達2年。隨著生活節奏加快,越來越多的患者要求縮短正畸治療療程。因此,加速正畸牙齒移動(orthodontic tooth movement, OTM)逐漸成為學者們關注的熱點。臨床上主要通過手術加速OTM,但適應證嚴格,存在不確定性、風險高等缺點。因此有必要研究調控破骨進程的有效靶點,加速正畸速率,縮短矯治療程。牙齒移動速度取決于破骨細胞數量和牙槽骨吸收活性。目前研究[2]表明大麻素2型受體(cannabinoid receptor 2, CB2)可能通過負調控破骨細胞在牙槽骨吸收過程中發揮作用。CB2主要分布于外周與免疫細胞,與骨代謝有關。研究[3]證明當CB2缺乏時,破骨細胞數量增加和功能增強, CB2基因敲除的中年小鼠牙槽骨密度顯著下降[4]。然而CB2在OTM過程中的影響尚不清楚,因此,該研究擬通過建立CB2-/-小鼠OTM模型,觀察CB2在正畸過程中對OTM速率和壓力區牙槽骨吸收的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SPF級CB2-/-小鼠購自北京集萃藥康生物科技有限公司。基于CRISPR/Cas9基因編輯技術構建C57BL/6J 品系 CB2基因敲除小鼠,與C57BL/6品系WT小鼠交配,獲得子代雜合子,然后使用子代雜合子互配獲取足量純合子和同窩野生小鼠用作實驗鼠。所有小鼠都飼養在無病原體條件下。SPF房溫度設定為(23±3)℃,保持相對濕度(60±5)%,維持標準的 12 h明暗循環。動物實驗方案通過河北醫科大學科研倫理審查委員會批準(批準號：20220301)。每鼠籠CB2+/-雄鼠與CB2+/-雌鼠以1 ∶2配繁,仔鼠出生3周到4周期間進行斷奶、基因型鑒定和分籠。

1.1.2主要試劑及儀器 基因組 DNA 提取試劑盒(DP304,天根,北京),TAE(ZS205-3,莊盟,北京),瓊脂糖(1613102EDU,伯樂,美國),核酸染料(ZS-M18006,中實同創,天津),DL2000 DNA Ladder(M0046,LifeSct LLC,美國),SYBR Green PCR 預混液(ZS-M13002,莊盟,北京),DNA上樣緩沖液(D0071,碧云天,上海),流動性光固化樹脂(3M ESPE,美國),酸蝕劑(3M ESPE,美國),4% 多聚甲醛(P0099,碧云天,上海),蘇木精-伊紅染色液(BA4025,貝索,珠海),抗酒石酸鹽酸性磷酸酶試劑盒(CR2107063,塞維爾生物,武漢),抗基質金屬蛋白酶-9抗體(ARG40613,Arigobio,上海),Tween 20(ZLI-9309,中杉金橋,北京),兔二步法試劑盒(PV-6001,中杉金橋,北京),戊巴比妥鈉(Merck,美國),伯樂梯度PCR儀(T100 Thermal Cycle,伯樂,美國),三恒多用電泳儀(DYY-6D,北京六一,北京),凝膠成像系統(G：BOX,Syngene,英國),正畸鎳鈦彈簧(CS-12-9,埃蒙迪,上海),正畸不銹鋼結扎絲(2.0,康橋,上海)。

1.2 方法

1.2.1小鼠基因分型 提取3周～4周齡仔鼠尾(0.5～1 cm )基因組DNA,根據北京集萃藥康提供的序列(表1),進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳,化學發光凝膠成像系統分析條帶大小。擴增產物只有294 bp左右條帶為CB2-/-小鼠;只有392 bp左右條帶為WT小鼠;擴增產物有294 bp和392 bp左右2條電泳條帶則為CB2雜合型小鼠(CB2+/-)(圖1)。

圖1 小鼠Cnr2基因PCR產物電泳圖

表1 引物信息

1.2.2實驗分組 選取體質量22～23 g的CB2-/-和同窩WT鼠雄性小鼠各30只,6周齡時建模,WT小鼠作為對照組,CB2-/-小鼠作為實驗組,接受牙移動裝置,建模時間分別為0、3、7、14和21 d;2種基因型的0 d組(n=6)小鼠均作為陰性對照,不做任何處理。

1.2.3建模方法 腹腔注射戊巴比妥鈉(0.008 ml/g)麻醉小鼠。經正畸鎳鈦螺旋拉簧(絲徑0.3 mm)的一端通過0.2 mm不銹鋼結扎絲固定于左側上頜第一磨牙上,另一端通過流動性修復樹脂直接粘結到上頜切牙上,固定的結扎絲兩端之間共計8圈彈簧,使用測力計準確測量裝置力值,施力裝置在30～40 ℃之間,提供恒定且持續的約20 g的力值,實驗期間不需要重新激活[5],上頜第一磨牙近中移動(圖2)。所有小鼠術后均給予軟食,術后每天檢查施力裝置在模型鼠口內狀態。

圖2 小鼠牙移動模型口內圖

1.2.4牙移動距離測量 在實驗的第0、3、7、14和21天,樣本選取左側上頜牙槽骨和牙在內的橫斷區域,使其根方橫斷面垂直于上頜合平面,獲取體視顯微鏡圖片,使用Image J軟件,測量圖片中左側上頜第二磨牙測量圖片中左側上頜第二磨牙近中邊緣嵴的中點至第一磨牙近中邊緣嵴的中點之間的距離,然后減去第一磨牙近遠中徑,獲得牙移動距離。

1.2.5組織學觀察 HE染色觀察第一磨牙遠中根牙周膜和壓力側牙槽骨的形態結構。Image J測量第一磨牙遠中根壓力側牙周膜寬度,通過自第一磨牙遠中根近中最凸點(根中1/3區域內)作垂直于遠中根的延長線,獲得該線延長至第一磨牙遠中根壓力側牙槽骨的距離。TRAP染色統計左側上頜第一磨牙遠中根壓力區附著于硬骨板表面凹陷的TRAP(+)破骨細胞數量。MMP-9抗原免疫組化染色統計左側上頜第一磨牙遠中根壓力區MMP-9的陽性表達細胞數量。

2 結果

2.1 成功構建CB2-/-和WT小鼠OTM模型模型鼠術后健康,無基因型差異,每種基因型納入30只OTM手術成功模型。

2.2 牙移動距離測定OTM 距離增加與施力時間呈正比,3 d組的OTM 距離最小,21 d組的OTM 距離最大。牙移動3、7、14和21 d組中,CB2-/-小鼠牙移動距離均較WT小鼠增加(圖3、表2),差異有統計學意義(P<0.000 1)。

圖3 不同時間兩組小鼠的牙移動距離

表2 牙移動距離分析

2.3 組織學改變0天WT小鼠牙周膜纖維排列正常,牙槽骨硬骨板清晰完整,骨小梁交織成網狀,CB2-/-小鼠骨小梁較WT小鼠稀疏。OTM 3 d時近遠中牙周膜間隙寬度不一致,在壓力側變窄,張力側變寬,兩種基因型OTM小鼠差異無統計學意義。OTM 7和14 d時CB2-/-小鼠壓力區牙周膜間隙寬度大于WT小鼠(圖4、圖5、表3)。

圖4 OTM牙周組織變化 HE×200

圖5 第一磨牙遠中根壓力區牙周膜寬度分析

表3 第一磨牙遠中根壓力區牙周膜寬度分析

2.4 牙移動壓力區破骨細胞數量觀察破骨細胞位于壓力區硬骨板骨吸收陷凹內呈酒紅色陽性顆粒。0 d組2種基因型小鼠的第一磨牙遠中根壓力區硬骨板均無破骨細胞。OTM 組3 d時 WT和CB2-/-小鼠的壓力區硬骨板上出現了少量破骨細胞。OTM 組7 d時2種基因型小鼠的破骨細胞數量與3 d組相比均增加,且CB2-/-小鼠的破骨細胞數量大于WT小鼠,差異有統計學意義(P<0.01)。OTM 組14 d時CB2-/-小鼠的破骨細胞數量大于WT小鼠,差異有統計學意義(P<0.001)。但14和21 d時CB2-/-小鼠的破骨細胞數量變化不大,表明在14 d時CB2-/-小鼠的破骨細胞數量達到峰值;而WT小鼠在第21天時數量達到最大值(圖6、圖7、表4)。

圖6 TRAP染色結果 ×200

圖7 OTM壓力區破骨細胞數量分析

表4 OTM壓力區破骨細胞數量分析

2.5 牙移動壓力區破骨細胞的早期募集和破骨活性觀察MMP-9(+)單核細胞晚期前體多位于牙周膜間隙,呈深黃棕色著色;MMP-9(+)多核細胞多位于硬骨板骨吸收陷凹內多核且胞質呈深黃棕色著色,有時可見明顯偽足(圖8)。0 d組CB2-/-小鼠的壓力區牙周膜區域MMP-9(+)單核細胞數量有大于WT小鼠的趨勢,但2種基因型小鼠均未見MMP-9(+)多核細胞。3和7 d時WT型和CB2-/-單核細胞和多核細胞數量差別無統計學意義。OTM 組14 d時,CB2-/-小鼠的MMP-9(+)單核細胞和兩種基因型的多核細胞數量達到最大值,且CB2-/-小鼠的MMP-9(+)單核細胞和多核細胞數量均大于WT小鼠,差異有統計學意義(P<0.05)(表5、6)。

圖8 OTM 壓力區MMP-9(+)單核細胞和MMP-9(+)多核細胞數量

表5 MMP-9(+)單核細胞數量

表6 MMP-9(+)多核細胞數量

3 討論

研究顯示正畸力值達到一定強度時,破骨細胞數量出現峰值,更大的力值則不會增加牙齒移動距離且引起牙根吸收[6]。為獲最佳牙移動和破骨細胞募集,所有加力裝置均采用20 g力值。螺旋彈簧模型提供恒定和連續的力,防止牙周炎樣組織反應,對建模牙齒的牙周組織的干擾最小[7]。為盡可能實現標準化OTM模型,本研究使用精心設計的鎳鈦彈簧的施力裝置。機械刺激有助于破骨細胞活化和骨吸收,但長期的機械刺激骨吸收程度反而下降[8]。研究[9]顯示OTM過程中牙槽骨阻力增加,3周后的大鼠牙齒移動減緩。本研究選擇觀察3周內的OTM模型。結果表明OTM模型成功建立,未發現明顯的牙根吸收和牙周炎癥,3周的觀察時間比較合理。CB2屬G-蛋白偶聯受體,其配體結合部位是7個跨膜螺旋相互作用形成的中央核心。CB2激活后,通過跨膜區的構象變化,將生化信息傳遞到細胞內,從而引發一系列生理活動,參與骨代謝[2],在牙周組織中廣泛表達,包括連接上皮、牙齦結締組織、牙周膜和牙槽骨表面[10]。牙移動速率是決定正畸治療療程的直接決定因素,縮短正畸治療周期的關鍵在于加速OTM,而壓力側牙周組織改建是OTM限速的關鍵,本研究主要關注CB2對正畸牙齒移動速率的影響,觀察小鼠CB2基因敲除后在正畸力作用下壓力側牙周組織的改變。結果顯示CB2-/-小鼠牙移動距離和壓力區牙周膜間隙寬度均較WT小鼠增加,提示CB2與牙齒移動速率相關。此外,Konermann et al[11]發現牙周膜細胞連續拉伸 20%的狀態下,在第48 小時,CB2 的蛋白表達下調。錢紅 等[12]發現CB2抑制可下調牙周膜細胞中機械牽張力引起的成骨基因高表達。以上研究表明CB2表達受機械力的影響,且在骨改建中起重要作用。因此,結合所有研究,推測CB2缺失通過促進骨改建,最終加速OTM。OTM 壓力側骨吸收是決定OTM速度的限速步驟,而OTM 壓力側的破骨細胞數量和骨吸收活性決定骨吸收速度。TRAP是破骨細胞的標志性酶,特異性分布于破骨細胞中。本研究中,OTM CB2-/-小鼠的TRAP陽性破骨細胞數量上調,表明CB2缺失影響破骨細胞的活性。Ofek et al[13]發現激活CB2通過促進成骨前體細胞有絲分裂擴大前成骨細胞數量,同時通過減少破骨前體細胞有絲分裂,抑制破骨細胞分化,以此參與骨重建過程。有研究[4]發現CB2缺乏可通過上調破骨細胞和破骨前體細胞數量導致牙槽骨低骨量表型。本研究結果與之基本一致,因此推測CB2缺失通過促進破骨細胞的分化,增加破骨細胞數目和骨吸收活性,加速壓力側骨吸收。MMP-9是一種前體和成熟破骨細胞的標志物,在OTM壓力區組織中高表達[7],機械力誘導的骨吸收過程促進破骨細胞的早期募集及提高骨吸收活性[14]。本研究結果提示CB2-/-小鼠較WT小鼠有更明顯的破骨細胞的早期募集。Zhu et al[15]發現CB2激動劑可抑制骨髓來源破骨細胞前體的分化和破骨能力,下調MMP-9和TRAP的表達。提示CB2缺失通過促進機械刺激性破骨細胞的早期募集及提高骨吸收活性促進壓力側骨吸收。綜上,CB2缺失通過促進機械刺激性破骨細胞的早期募集及提高骨轉換促進正畸牙齒移動,但是其中參與的信號通路還有待于進一步研究。

CB2積極參與正畸牙移動過程,CB2缺失通過調節機械刺激性破骨過程參與正畸骨吸收過程,提高牙移動速率。提示靶向干預CB2的表達或可為正畸牙齒移動的精準干預的潛在靶點提供新的思路和線索,同時為臨床上加速牙移動和縮短正畸療程提供基礎研究數據。本研究尚有不足,僅從功能表型層面探討CB2缺失在加速牙移動中的作用,應結合體外實驗,從分子、細胞、組織等不同級別進一步探究該作用背后的具體機制。