Neurogenin1基因在神經發生中的作用機制及相關中醫藥治療研究進展*

張琳琳 章 潔

1 天津中醫藥大學第二附屬醫院腦病針灸科,天津市 300250; 2 天津中醫藥大學

神經發生(neurogenesis)是指從神經干細胞(Neural stem cell,NSCs)增殖、分化為神經元或神經膠質細胞,并逐漸向功能區域遷移、發生可塑性變化并與其他神經元建立突觸聯系從而產生神經功能完整的過程。在此過程中,多種內源性的信號分子參與并調控干細胞的增殖與分化。其中Neurogenin1基因(簡稱Ngn1),作為堿性螺旋—環—螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)蛋白家族中的成員之一,能在神經前體細胞(neuronal precursors)中被強烈誘導表達,并調控神經前體細胞分化為神經元細胞,且抑制其向星形膠質細胞分化[1],為調控NSCs分化的重要因子,在神經發生過程中發揮著關鍵的作用,與神經系統多種疾病具有相關性,目前發現,可通過中醫藥手段對Neurogenin1基因的表達進行干預,從而對相關神經系統疾病起到一定的治療作用,現將其總結如下。

1 Ngn1簡介

Ngn1基因包括Ngn1、Ngn2和Ngn3,是堿性螺旋—環—螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)轉錄因子的家族成員之一[2],在哺乳動物的CNS中廣泛表達,包括海馬中的錐形和顆粒神經元、嗅球中的谷氨酸能中間神經元、皮質中的錐體細胞和丘腦的大部分等區域。該家族是生物發育過程中轉錄網絡的重要組成部分,在哺乳動物的神經系統中,不同類型的bHLH轉錄因子彼此調控、互相協調,廣泛參與了神經發生與細胞增殖分化等基本生理過程,其中Ngn1和Ngn2在神經發生時活躍,Ngn3在胰腺組織和胰島素分泌細胞的發育中需要[3]。Ngn1定位于5號染色體,最初在非洲爪蟾中發現[4],在谷氨酸螺旋神經節神經元的分化中起關鍵作用。它通過激活NeuroD1、Brm3a、GATA3和神經營養因子受體的下游級聯,促進谷氨酸螺旋神經節神經元的正常分化[5]。同時,Ngn1具有決定神經元特性和亞型的功能,其生成的數量與特性在時間與空間上的順序受限于增殖的神經祖細胞[6]。Ngn1可強烈誘導與神經細胞遷移相關的基因,激活神經發生的程序,包括細胞表面變化,誘導基因參與細胞遷移、轉錄因子和細胞周期調控因子[7]。可能通過干擾轉錄輔助因子介導多個啟動子綁定的轉錄因子抑制膠質細胞基因激活。

2 Ngn1在神經發生過程中的作用

神經細胞分化的過程極其復雜,在不同階段均有特定的標志基因被開放或關閉,Ngn1能夠刺激神經祖細胞的神經元分化,但抑制膠質細胞分化[5],并對神經細胞亞型的分化起著關鍵作用。目前Ngn1在神經發育中已經得到較深入的研究。從非洲爪蟾和斑馬魚的神經管的分化、小鼠和雞的皮質祖細胞體外誘導分化,再到誘導小鼠胚胎p19癌細胞等,Ngn1都是不可或缺的角色。Blader等[8]研究了斑馬魚胚胎發育過程中Ngn1基因調控情況,證實脊椎動物胚胎盡管缺乏原代神經元,但可通過相關的機制來誘導Ngn1表達。Murray等[9]首先克隆了小鼠Ngn1基因啟動子區DNA2.7kb第一外顯子片段,發現在內源性Ngn1條件誘導下對其神經系統特異表達具有決定作用。吳萌[10]以全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,atRA,簡稱RA)誘導小鼠胚胎瘤p19細胞分化模型模擬了胚胎干細胞被誘導轉變為神經干細胞,繼之成為神經前體細胞,直至終末分化成神經元細胞的整個過程,發現在此過程中Ngn1表達顯著提高,其區域組蛋白H3多個位點出現乙酰化修飾狀態,提示與Ngn1表達激活調控有關。Ngn1在缺血性卒中模型也有研究。急性卒中動物模型中,注射表達Ngn1神經誘導的骨髓間充質干細胞比注射親代間充質干細胞更能有效地緩解神經功能缺損,且Ngn1的神經誘導可增強骨髓間充質干細胞的歸巢能力,提高其在缺血大鼠腦內的植入效率[11]。閆曉波等[12]通過觀察試管缺氧培養模型后發現,Ngn1能促進成鼠大腦室下區缺氧后NSCs增生,認為Ngn1在成鼠大腦缺血性腦卒中誘發的神經再生過程中可能具有促進其增殖的作用。此外,也有研究[13]認為,Ngn1和β-catenin對缺氧缺血性腦損傷后神經干細胞的增殖和分化的共同協調,促進了神經元進行自我修復。

3 Ngn1與相關通路

3.1 Ngn1與JAK/STAT通路 大腦的神經元網絡是十分復雜的,Ngn1促進神經發生和抑制星形膠質細胞形成是通過調節特定基因的活性來實現。JAK/STAT通路在神經損傷、神經修復和免疫系統中發揮重要作用,就神經發生而言,它一直充當著開關的角色:體外研究表明,Ngn1激活的同時會與啟動子miR-9結合, 下調JAK/STAT途徑上的關鍵成分, 實現Stat磷酸化的抑制, 從而抑制星形膠質細胞的形成[14]。使NSCs開始向神經元方向分化。因此Ngn1對NSCs的分化具有競爭性調控作用。

3.2 Ngn1與CBP/p300 作為轉錄共激活因子之一,環磷酸腺苷反應元件結合蛋白(CREB binding protein,CBP)結合原件組蛋白乙酰化酶CBP/p300目前受到廣泛關注[15],CBP/p300屬于組蛋白乙酰化酶的兩個亞型,廣泛參與各種組蛋白的乙酰化修飾,使染色質的空間結構變得疏松,利于基因表達。它能與多種轉錄因子相互作用,使轉錄因子被募集到啟動子區域,促進轉錄起始復合物的形成,共同激活星形膠質細胞表達的相關基因。但Ngn1通過蛋白質—蛋白質相互作用,將激活劑復合物遠離神經膠質分化基因。具體來說就是Ngn1螯合CBP/p300-Smad1的轉錄共激活因子復合物,從而阻斷其與STAT膠質分化因子的相互作用,實現抑制星形膠質細胞特異性基因轉錄的作用[16]。

3.3 Ngn1與Wnt信號通路 Ngn1同時受Wnt信號的調節,β-catenin是Wnt信號通路中的關鍵分子,且作為Ngn1的上游基因,能上調Ngn1的表達[17]。Wnt蛋白通過自分泌或旁分泌作用與細胞膜上的受體結合,激活細胞內信號通路,特異地啟動、激活下游靶基因的轉錄,從而在胚胎的發育過程中對細胞的增殖、分化、遷移、極性化和凋亡等過程進行調節[18]。在經典Wnt信號通路中充當細胞內信號轉導的β-catenin/TCF復合物直接結合Ngn1 mRNA以促進Ngn1蛋白在皮層神經元前體細胞中的轉錄,從而促進神經發生。

3.4 Ngn1與Notch信號通路 目前Notch信號通路已被認為對NSCs的發育至關重要,該信號通路是一條保守的信號轉導途徑,由兩個鄰近細胞的Notch受體與其配體相互作用而激活。研究表明,Notch信號通路通過抑制神經元分化和軸突再生,促進反應性星形膠質細胞增生[19],其靶基因主要是bHLH轉錄因子,包括Hes1、Hes5、Mash1、Ngn1和Ngn2等[20]。Notch信號負調節Ngn1表達,其中Hes1基因持續的過表達能下調Ngn1的表達,即Hes1可以起到拮抗易位基因Ngn1的活性,從而維持NSCs的穩定。

4 Ngn1與相關疾病

4.1 Ngn1與ALS 肌萎縮脊髓側索硬化癥(ALS)又稱“漸凍人癥”,是指上運動神經元和下運動神經元損傷之后,導致包括球部(所謂球部,是指延髓支配的這部分肌肉)、四肢、軀干、胸部腹部的肌肉逐漸無力和萎縮。有研究表明,ALS發病過程主要由激活的小膠質細胞和星形膠質細胞及其釋放的活性物質所介導的多種細胞之間復雜的相互作用所引發[21]。長期以來ALS的治療一直成為醫學領域無法攻克的難題,對此進行了大量的研究實驗,其中有研究發現[22]在成年轉基因模型鼠脊髓中Ngn1表達明顯減少,推測ALS的發生與Ngn1的下調相關。治療上[23],通過在間充質干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)中表達Ngn1基因,并移植到ALS小鼠模型中的神經元誘導可導致神經元樣細胞遷移到CNS,系統移植MSCs-Ngn1可通過調節對單核細胞化學誘導蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)受體的表達水平及體外遷移活動對宿主神經細胞產生有利影響,提示神經誘導移植MSCs對長期治療ALS有潛在益處,Ngn1的作用必不可少。若能在發病前期移植,MSCs-Ngn1可延遲疾病發作進展,而未經處理的MSCs無效[23],這將為ALS的治療提供新的思路。

4.2 Ngn1與阿爾茨海默病 阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)又稱老年性癡呆,是由神經元或神經膠質細胞缺陷引起,導致記憶衰退、認知障礙、癡呆和肢體運動障礙[24],為中樞神經系統退行性疾病之一,起病隱匿、進展性加重且不可治愈是其主要特點,近年來針對其發病及治療機制研究逐漸深入,其中內源性誘導NSCs增殖與分化,替代損傷或壞死的神經細胞并重建神經通路,從而改善學習記憶能力,是干細胞治療AD的機理之一。據報道,AD患者海馬神經元線粒體較正常人有所減少,而在將NSCs移植到轉基因AD小鼠模型中,發現其線粒體數量和線粒體相關蛋白表達顯著增加[25],增加了神經細胞能量輸出及其效率。Ngn1在神經發生過程中具有競爭性調控NSCs向神經元分化的關鍵作用,同樣也參與了AD治療某些關鍵環節[26]。海馬齒狀回顆粒下區的神經發生可以作為AD中的內源性修復機制,已有研究證實MSCs能在淀粉樣蛋白-β(Aβ)相關的AD模型中通過增強Wnt信號通路促進神經元祖細胞分化為成熟神經元,調控海馬神經發生[27]。本研究團隊長期致力于補腎中藥防治AD的臨床與機制研究,研究發現[28]益腎化濁方能明顯改善AD模型大鼠學習記憶能力,提高其海馬區Ngn1基因表達水平,促進神經元Tubulin蛋白表達,抑制GFAP蛋白表達,由此推測益腎化濁方可能通過調控NSCs的分化促進神經元再生,進而改善其學習記憶功能,該作用與調控Ngn1基因的表達密切相關。

4.3 Ngn1與精神分裂癥 多重證據表明精神分裂癥源自異常的神經發育,因此參與腦結構發育的基因序列變異可能與導致精神分裂癥中的結構變化發生重疊。目前在Ngn1基因敲除小鼠中觀察到丘腦的發育不良[29],與在精神分裂癥中看到的丘腦結構異常相似。有人[30]測序了來自愛爾蘭高度精神分裂癥家庭25名受試者的Ngn1基因,使用譜系不平衡試驗(Pedigree Disequilibrium Test,PDT)和復雜疾病家系關聯性分析(FBAT)發現,兩個Ngn1相關的單核苷酸多態性(SNPs)的主要等位基因位點(rs2344484-C和rs8192558-G)在精神分裂癥患者中更普遍,證明Ngn1變體可能對精神分裂癥易感性有一定的影響,但需要更大的樣本量來證實,必須注意的是Ngn1和精神分裂癥之間存在相應的關系[31]。

5 Ngn1與相關疾病的中醫治療

由于神經系統的特殊性,目前很多神經系統疾病都缺乏有效的治療措施。Ngn1可以通過對神經干細胞分化功能進行調控,從而達到神經再生、恢復相關神經功能等目的。但目前,尚未發現可具體調控Ngn1基因表達的方法。但有相關研究表明,中醫藥治療手段可以很好地達到增加Ngn1 基因表達的功效,從而達到有效治療目的。

5.1 中藥治療 神經再生與中醫理論中“腦髓”功能活動相類似,那么人腦內神經元受損缺失的病理基礎可能與腎中精氣虧虛相關聯[32]。實驗研究表明,益腎化濁方可能通過增加AD模型中大鼠海馬區Ngn1基因的表達,促進神經元再生及神經干細胞增殖并誘導其向神經元分化[28];缺血性卒中在我國發病率極高,中醫上稱之為“中風”,其后遺癥期基本病機以“氣虛血瘀”最為多見。補陽還五湯具有補氣活血通絡的功效,臨床中可以起到很好的改善中風后遺癥效果。研究發現,補陽還五湯可通過調節 NSCs Notch信號通路相關因子Ngn1等基因的表達水平從而促進 NSCs 的增殖[33]。

5.2 針灸治療 目前研究發現,針灸治療可以通過干預各類信號通路,從而調控NCSs增殖分化,達到抑制細胞凋亡、促進神經修復與再生的目的[34]。實驗研究表明,對大椎穴、次髎穴等穴位進行電針治療,可以通過調控Wnt/β-catenin信號通路中Ngn1蛋白表達,達到促進脊髓內源性神經干細胞增殖與活化的目的,從而改善完全性骶上脊髓損傷后神經源性膀胱大鼠的尿流動力學[35];此外,火針干預后的脊髓損傷模型大鼠Ngn1和Cyclin D1的基因表達量均明顯升高,說明火針療法也可以調控Ngn1和Cyclin D1的基因表達,從而達到恢復相關神經功能的作用[36]。

6 結語

目前對Ngn1的功能已有很多研究報道,但對其所調控的認識仍非常有限。例如Ngn1的轉錄如何被控制、活性如何調節、如何被募集到目的基因等都還有待進一步研究,可能與其他基因相似,受到多水平的調控。總體來說,Ngn1發揮作用的具體機理研究及如何與中醫藥治療方法相結合將是今后研究的一個重要內容。深入研究Ngn1的功能和調節將有助于我們更好地理解神經系統發育的分子調控機制,以及為NSCs治療諸多難治性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、精神分裂癥等提供潛在的治療途徑或假設。