12例肺癌患者的肺部微生態(tài)特征分析

卓德斌，王善鉆

福建莆田學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，莆田 351100

許久以來(lái)，人們?cè)e(cuò)誤地認(rèn)為肺臟是無(wú)菌環(huán)境，這個(gè)結(jié)論隨著新一代測(cè)序技術(shù)在微生物檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用被推翻[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在下呼吸道分泌物中均發(fā)現(xiàn)了低密度、多樣化的微生物群落[2-3]。既往許多研究表明，健康者與呼吸道疾病患者下呼吸道的微生物是有區(qū)別的，且機(jī)體處于不同疾病狀態(tài)時(shí)其微生物組成也存在差異[4-5]。肺部微生態(tài)與肺部疾病發(fā)生、發(fā)展間的關(guān)系已有諸多報(bào)道，特別是研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者與健康人群微生態(tài)特征不同。但是不同病理類型、不同臨床分期的肺癌患者其微生物組是否有差異，目前相關(guān)的研究則相對(duì)較少。因此，有必要探索不同病理類型、不同臨床分期的肺癌患者的微生物組特征。本研究將收集肺癌患者的支氣管沖洗液，探索不同病理類型，不同臨床分期的肺癌患者的微生物組特征，分析肺癌患者呼吸道微生物與預(yù)后間關(guān)系是否存在相關(guān)性，從而更深入地對(duì)肺癌的生物學(xué)特征有更為深刻的認(rèn)識(shí)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集從2021 年1 月到2021 年6 月就診莆田學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科經(jīng)氣管鏡病理活檢術(shù)初次確診的肺癌患者臨床資料。活檢前于肺癌病灶周圍行支氣管沖洗，收集灌洗液；采集該批患者首次住院期間完整的電子病歷資料。對(duì)其支氣管沖洗液進(jìn)行分析其菌群特征；詳細(xì)記錄患者的人口學(xué)資料、臨床相關(guān)癥狀、臨床檢驗(yàn)資料、胸部影像學(xué)等相關(guān)臨床資料。本研究獲本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡在30～85 歲、無(wú)纖維支氣管鏡活檢術(shù)禁忌證，經(jīng)組織病理結(jié)果確診為肺癌的患者；入院前1 周無(wú)抗感染治療；完善纖維支氣管鏡檢查前未接受介入手術(shù)、化療、放療或其他腫瘤相關(guān)治療；電子病例資料完整。

排除標(biāo)準(zhǔn)：合并阻塞性肺炎；合并支氣管哮喘、肺結(jié)核、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、糖尿病等可能影響微生物組的其他疾病；工作原因，曾有石棉、油漆、電焊等特殊接觸史患者；患者的臨床信息記錄不完整。

1.2 方法 標(biāo)本采集、標(biāo)本管理、病原體檢測(cè)方法如下：①支氣管沖洗液標(biāo)本采集：患者行纖維支氣管鏡檢查過(guò)程中，在行活檢術(shù)前使用2～30 ml 無(wú)菌生理鹽水對(duì)病灶周圍氣道進(jìn)行沖洗，使用一次性滅菌集痰器收集病灶周圍支氣管沖洗液。②支氣管沖洗液標(biāo)本管理：住院患者支氣管沖洗液標(biāo)本收集完后，對(duì)其進(jìn)行編號(hào)以及患者信息標(biāo)記，于1 h 內(nèi)放入－20℃冰箱中保存，后轉(zhuǎn)至－80℃箱中進(jìn)行凍存。③病原體檢測(cè)：將支氣管沖洗液標(biāo)本送檢二代測(cè)序（NGS），通過(guò)物理破壁后，酶破壁混合震蕩后提取DNA，使用MGISEO-2000 系統(tǒng)（MGITech CoLtd.）進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)BWA（http://bio-bwa.sourceforge.net/）與華大PMDB病原數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)序列數(shù)的高低、檢測(cè)深度、檢測(cè)離散度及基因組覆蓋度來(lái)判斷可能的病原體。

1.3 觀察指標(biāo) 對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析整理，探索肺癌不同病理類型、不同腫瘤分期的病原微生物特征。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析，繪圖軟件則采用GraphPad、Origin、STAMP等。計(jì)數(shù)資料服從正態(tài)分布時(shí)，使用t檢驗(yàn)作兩組間的比較；若資料不服從正態(tài)分布或有序等級(jí)資料時(shí)，使用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)方法：兩樣本間的檢驗(yàn)方法采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)，多樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。對(duì)計(jì)數(shù)資料則使用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 研究結(jié)果

2.1 患者一般資料 本研究納入的12 例患者中，11 例男性，1 例女性。年齡范圍為54～79 歲，平均年齡為（68.16±12.63）歲。病理分型為4 例肺鱗狀細(xì)胞癌[病例序號(hào)1、3、5、6，均為男性，平均年齡（68.25±2.18）歲]，6 例肺腺癌[病例序號(hào)2、7、8、9、11、12，平均年齡（66.33±7.73）歲]，1 例肺惡性腫瘤（病例序號(hào)4）以及1 例肺部非典型癌（病例序號(hào)10）。患者的基礎(chǔ)疾病以心腦血管疾病為主，主要診斷均為肺惡性腫瘤。見(jiàn)表1。

表1 12例患者的一般資料

2.2 12 例患者的支氣管沖洗液標(biāo)本的菌群分布 在12 例患者支氣管沖洗液標(biāo)本的菌群中，肺炎克雷氏伯桿菌（病例序號(hào)5、7、9，分別為鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、肺腺癌）、產(chǎn)黑色素普雷沃氏菌（病例序號(hào)8、10、11，分別為肺腺癌、非典型類癌、肺腺癌）和結(jié)核分枝桿菌（病例序號(hào)6、9、10，分別為鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、非典型類癌）各出現(xiàn)了3 次，白色念珠菌（4、12，分別為肺惡性腫瘤、肺腺癌）和緩癥鏈球菌（病例序號(hào)1、3，均為鱗狀細(xì)胞癌）出現(xiàn)了2 次。其余菌種均只出現(xiàn)1 次。見(jiàn)表2。

表2 12例患者的支氣管沖洗液標(biāo)本的菌群分布

2.3 12 例患者的治療方案 在對(duì)12 例患者的治療方案中，培美曲塞（病例序號(hào)2、4、7、9，分別為肺腺癌、肺惡性腫瘤、肺腺癌、肺腺癌）和卡鉑（病例序號(hào)2、3、5、6、7，分別為肺腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌）使用最多；紫杉醇使用2 次，均在鱗狀細(xì)胞癌；順鉑使用2 次，分別為肺腺癌和非典型類癌。菌群無(wú)明顯改變。見(jiàn)表3。

表3 12例患者的菌群分布與治療方案

3 討論

在過(guò)去的數(shù)十年里，在理解微生物組與癌癥相互作用方面取得了巨大進(jìn)展。然而，大多數(shù)研究都集中在腸道微生物組上，忽略了其他微生物組如何與腫瘤相互作用。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，在許多類型的癌癥中，如肺癌、胰腺癌和結(jié)直腸癌，腫瘤內(nèi)微生物組起著重要作用。此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明，腫瘤內(nèi)微生物對(duì)腫瘤的生物學(xué)行為具有多重影響，例如，調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展以及改變腫瘤對(duì)化療和免疫治療的反應(yīng)[6]。然而，為了充分了解腫瘤內(nèi)微生物組在癌癥中的作用，仍然需要進(jìn)一步研究其作用和機(jī)制。

最近的證據(jù)表明，肺部微生物群可以被認(rèn)為是各種呼吸系統(tǒng)疾病的生態(tài)決定因素之一。有學(xué)者比較了常見(jiàn)呼吸系統(tǒng)疾病的肺部微生物群和肺部免疫特征，使用MiSeq 測(cè)序系統(tǒng)分析呼吸疾病（肺癌、原發(fā)性肺結(jié)核、社區(qū)獲得性肺炎）患者的支氣管肺泡灌洗液，發(fā)現(xiàn)肺癌患者的細(xì)菌多樣性和豐富度均高于原發(fā)性肺結(jié)核和社區(qū)獲得性肺炎患者[7]。線性判別分析效應(yīng)量顯示，原發(fā)性肺結(jié)核組和肺癌組社區(qū)獲得性肺炎相關(guān)肺微生物群差異顯著。在原發(fā)性肺結(jié)核組和肺癌組中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵功能細(xì)菌差異屬多于社區(qū)獲得性肺炎組。交互作用網(wǎng)絡(luò)顯示肺癌組與這些細(xì)菌屬之間的正負(fù)相關(guān)性強(qiáng)于其他兩組[8]。然而，在原發(fā)性肺結(jié)核組中觀察到支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞因子譜高于其他兩組，而支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞因子與關(guān)鍵功能細(xì)菌相關(guān)[9]。這項(xiàng)研究為肺微生物群改變、支氣管肺泡灌洗液炎癥和不同呼吸系統(tǒng)疾病之間的關(guān)聯(lián)提供了證據(jù)，從而促使研究者們開(kāi)始深入了解肺微生物群在呼吸系統(tǒng)疾病進(jìn)展中的可能作用和機(jī)制。肺癌患者、肺部病變患者、健康人的支氣管中都存在擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、變形桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)等微生物；其中肺癌患者的普氏桿菌屬是優(yōu)勢(shì)菌群，與肺部病變患者、健康人有明顯差異[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者的微生物構(gòu)成以擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)為主，如無(wú)色菌屬、不動(dòng)桿菌屬、放線菌屬等，同時(shí)庫(kù)克菌屬、鏈球菌屬和葡萄球菌屬等機(jī)會(huì)性致病菌也在肺癌患者中廣泛存在[11-12]。此外，肺部菌群變化和免疫相關(guān)，在免疫治療前、治療中或治療后不久使用抗生素治療降低了免疫治療對(duì)肺癌的療效[13]。可見(jiàn)，進(jìn)一步闡明肺微生物與宿主免疫狀態(tài)之間的關(guān)系，可以發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，有助于發(fā)掘新的治療方法。

本研究發(fā)現(xiàn)，本研究的12 例患者中，病理分型為4 例肺鱗狀細(xì)胞癌、6 例肺腺癌、1 例肺惡性腫瘤以及1 例肺部非典型癌；平均年齡為（68.16±12.63）歲；患者的基礎(chǔ)疾病以心腦血管疾病為主，主要診斷均為肺惡性腫瘤。在12 例患者支氣管沖洗液標(biāo)本的菌群中，共發(fā)現(xiàn)了緩癥鏈球菌、鏈球菌、米勒鏈球菌、嗜麥芽窄食單胞菌、麻疹孿生球菌、巨細(xì)胞病毒、銅綠假單胞菌、鮑氏不動(dòng)桿菌、白色念珠菌、肺炎克雷伯桿菌、結(jié)核分枝桿菌等18 種菌種；革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌各6 種。在這些菌種中，肺炎克雷氏伯桿菌、產(chǎn)黑色素普雷沃氏菌和結(jié)核分枝桿菌各出現(xiàn)在3 例患者的支氣管沖洗液中，白色念珠菌和緩癥鏈球菌出現(xiàn)在了2 例，其余菌種均只出現(xiàn)1 次。在12 例肺癌患者中，存在鏈球菌、草綠色鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌、假絲酵母菌。12 例患者的治療方案中，培美曲塞（應(yīng)用在肺腺癌、肺惡性腫瘤、肺腺癌、肺腺癌）和卡鉑（應(yīng)用在肺腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌）使用最多；紫杉醇使用2 次，均在鱗狀細(xì)胞癌；順鉑使用2 次，分別為肺腺癌和非典型類癌。患者在治療前后菌群無(wú)明顯變化。

肺癌患者呼吸道微生物中的物種多樣性及結(jié)構(gòu)多樣性可能存在明顯差異，但各研究結(jié)論不全一致。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者的支氣管菌群中以鏈球菌、草綠色鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌、假絲酵母菌為主；肺癌患者的治療以培美曲塞、卡鉑、紫杉醇、順鉑為主。