m6A甲基化修飾與宮頸癌

丁瑤瑤 沖喜會 魏林珍綜述 朱姣姣 張倩倩 陳 凡 秦天生審校

2018年全球癌癥統計,宮頸癌被公認為第二大最常見的惡性腫瘤,其死亡率在女性中位居第二[1]。宮頸癌在中低收入國家的發病率和死亡率較高[2],其中印度(病例:97000,死亡:60000)和中國(病例:106000,死亡:48000)加起來占全球宮頸癌的三分之一以上[3]。盡管人乳頭瘤病毒的疫苗和篩查廣泛應用于臨床,但臨床中宮頸癌的診斷和治療仍備受關注。

近幾十年來,RNA的表觀遺傳調控已成為一個熱門話題,RNA m6A修飾在癌癥研究中已發展成為最熱門的領域之一。表觀遺傳調控抑制劑,如氮胞苷和地西他濱,是DNA甲基化的兩種抑制劑,在臨床應用中顯示出巨大的抗癌效果。在人類癌癥中常發生m6A修飾的失調,其主要通過調控癌癥基因表達來調節腫瘤細胞的生長行為和惡性程度。近年來許多研究表明異常的m6A修飾與宮頸癌進展和患者預后密切相關。Ma等[4]證明了13種主要的m6A RNA甲基化調節因子中在306個宮頸癌組織中根據不同臨床病理特征分層的大多數中有不同的表達,并確定了兩個宮頸癌亞組命名為RM1/2;與RM1相比,RM2的預后較差,總生存率(OS)較低,表明m6A RNA甲基化調節因子與宮頸癌密切相關,因此我們使用m6A RNA甲基化調節因子衍生出一種風險標記物,它不僅是一種獨立的預后標記物,而且可以預測宮頸癌的臨床病理特征。研究證明了METTL3和CD33+在宮頸癌中關系的綜合結果,并揭示了METTL3在體外可誘導直接的髓源性抑制細胞(MDSC)和腫瘤相關的MDSC分化;結果表明,這兩種生物標志物都是預后的不良指標并且可能在宮頸癌的微環境中有重要作用,該研究可能為進一步研究METTL3在宮頸癌微環境中調節MDSC介導的免疫抑制機制提供線索[5]。因此,作用于m6A修飾調節因子可能是有希望且具有潛力的宮頸癌治療靶點。

1 m6A

1.1 m6A的功能

N6-甲基腺苷(m6A)作為真核細胞mRNA中最常見的化學修飾之一,影響無數生命的過程,如在胚胎干細胞分化[6]、大腦發育[7]、突觸可塑性[8]、造血[9]和癌癥進展中起著關鍵作用[10]。N6甲基腺苷(m6A)修飾是mRNA21腺苷堿基第6個氮位的甲基化[11]。m6A甲基化可由甲基轉移酶催化,如METTL3/14/16(“編寫者”),由去甲基酶FTO和ALKBH5(“橡皮擦”)去除,并與m6A結合蛋白相互作用,如YTHDF1/2/3和IGF2BP1/2/3(“閱讀器”)[11]。m6A修飾在由甲基轉移酶或甲基轉移酶操作的mRNA上是動態可逆的。總之,m6A書寫器、擦除器和讀取器的表達水平調節人類癌細胞中的RNA甲基化。可逆的RNA甲基化通過其對轉錄、剪接、mRNA穩定性和翻譯速率的影響,調節癌細胞的基本特征[12]。

1.2 m6A在人類癌癥中的作用

許多研究發現m6A甲基化與人類疾病的發生發展密切相關,尤其在人類癌癥中對癌細胞的調節更為明顯。在乳腺癌干細胞(BCSCs)中,NANOG mRNA中m6A的水平因缺氧依賴性ALKBH5上調而降低,從而提高了BCSCs的穩定性和NANOG蛋白水平[13]。將膠質母細胞瘤中的METTL3或METTL14基因敲除,使ADAM19、EPHA3和KLF4等幾種癌基因的表達水平上調,而這幾種癌基因在過度表達METTL3或METTL14的膠質母細胞瘤中表達水平下調;通過m6A免疫沉淀證實了ADAM19 mRNA的m6A水平的變化[14]。FTO是m6A的去甲基化酶,研究者發現通過降低mRNA轉錄物中的m6A水平,調控錨蛋白重復行列和含SOCS盒2(ASB2)和維甲酸受體α(RARA)等靶基因的表達,使白血病癌基因介導的細胞轉化增強和白血病發生并抑制全反式維甲酸(ATRA)誘導的AML細胞分化;ASB2和RARA在正常造血過程中上調,是ATRA誘導白血病細胞分化的關鍵調節因子,表明FTO對ASB2和RARA表達的抑制有助于急性髓系白血病細胞對ATRA治療的反應[15]。METTL14的敲除使RNA中m6A水平降低并增加了體內外的腫瘤轉移,另外METTL14下降是肝細胞癌的不良預后因素;METTL14被證實與微處理器蛋白DGCR8相互作用,并以m6A依賴的方式積極調節初級microRNA-126過程。這項研究表明,RNA中的m6A模式參與了腫瘤生物學,METTL14和microRNA信號之間的相互作用可能指向HCC的一個可能治療靶點[16]。在肝細胞癌中m6A調節器的去調節通過調節mRNA穩定性和翻譯效率來調節不同下游靶點的表達,需要進一步的研究來解決m6A修飾和m6A調節因子在肝癌發展中的異質性和復雜性[17]。Fan等[18]研究發現METTL14在胃癌組織樣本中下調,在體外和體內METTL14的異位表達顯著抑制胃癌細胞的生長和侵襲,而METTL14的敲除具有相反的作用,circORC5確定為METTL14的下游靶點,METTL14的沉默降低了circORC5的m6A水平但增加了circORC5的表達,表明METTL14低表達是胃癌患者生存率低的一個預測因素。m6A由RNA甲基轉移酶METTL3、METTL14和METTL16(編寫者)催化,被去甲基酶FTO和ALKBH5(清除器)去除,并與m6A結合蛋白相互作用,如YTHDF1和IGF2BP1(讀取器),RNA甲基轉移酶、去甲基化酶和M6A結合蛋白在多種器官來源的人類癌癥組織中經常上調,增加癌轉錄物和癌蛋白表達、癌細胞增殖、存活、腫瘤起始、進展和轉移[11]。Huang等[19]分析了轉移性骨肉瘤中21種m6A RNA甲基化調節劑的表達和預后價值,并利用RBM15沉默和過度表達前后的體外細胞學實驗以及體內轉移模型進一步驗證了這些調節劑,發現m6A RNA甲基轉移酶RBM15在骨肉瘤的發生和轉移中起關鍵作用。Shen等[20]首次深入了解了m6A修飾的lncRNA在透明細胞腎細胞癌中的功能和機制,并確定了透明細胞腎細胞癌進展中的“METTL14-YTHDC1-Lnc-LSG1”調節軸,強調了METTL14和lncRNA m6A修飾在透明細胞腎細胞癌發展中的重要作用。以上研究充分說明了m6A在人類癌癥中的重要影響,因此為了遏制癌癥對人類生命的威脅需要進一步對其進行研究。

2 m6A在宮頸癌中的作用機制

m6A RNA修飾通過調節RNA轉錄、剪接、加工、翻譯和衰變發揮作用,并參與多種惡性腫瘤的發生和轉移。Geng等[21]研究發現METTL14的下調抑制了SiHa和C33a細胞的增殖、遷移和侵襲能力,沉默METTL14可誘導宮頸癌細胞的細胞周期停滯;METTL14基因敲除通過降低Akt和mTOR的磷酸化來抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路,并且下游凋亡相關蛋白的表達也受到影響,這些數據表明METTL14在HPV陽性和HPV陰性宮頸癌細胞的生長和侵襲中起著重要的致癌作用。Li等[22]研究證明m6A可以通過調節PDK4來調節癌細胞的糖酵解,5′UTR的甲基化對m6A介導的mRNA穩定性和翻譯至關重要;由于大量基因參與細胞代謝,不能排除m6A修飾通過間接靶向其他基因來調節代謝過程的可能性,該研究表明,m6A通過誘導PDK4調節宮頸癌的糖酵解。METTL3在宮頸癌組織和細胞中顯著上調,這與宮頸癌患者的淋巴結轉移和不良預后密切相關[23]。Wang等[23]研究發現了METTL3在宮頸癌致癌和糖酵解效應中的關鍵作用,m6A修飾的HK2 mRNA受m6A讀取器蛋白YTHDF1調節,該蛋白識別m6A并增強靶轉錄物的穩定性,METTL3招募YTHDF1來調節HK2 mRNA的穩定性,通過加速糖酵解,通過YTHDF1/HK2軸發揮致癌作用,從而為宮頸癌提供一個潛在的預后生物標志物。Wang等[24]發現YTHDF1在宮頸癌中高表達,并且與宮頸癌患者的不良預后密切相關。YTHDF1基因敲除抑制宮頸癌細胞的生長、遷移和侵襲并誘導其凋亡,也抑制了宮頸癌細胞在體內的腫瘤發生。通過對YTHDF1基因敲除后RIP-seq、meRIP-seq和Ribo-seq的聯合在線數據分析,RANBP2被確定為YTHDF1在宮頸癌細胞中的關鍵靶點;YTHDF1以m6A依賴的方式調節RANBP2翻譯而不影響其mRNA表達,RANBP2促進宮頸癌細胞的生長、遷移和侵襲,該研究說明通過調節的表達證明了YTHDF1在宮頸癌中的致癌作用。E6/E7可以通過IGF2BP2介導的m6A-MYC mRNA在體外和體內的調節來調節宮頸癌細胞的有氧糖酵解。細胞代謝是一個涉及眾多基因活性的復雜過程,不能排除E6/E7也可能通過以IGF2BP2依賴的方式影響miRNA(而非MYC)的甲基化狀態來靶向有氧糖酵解[25]。Hu等[25]人發現HPV E6/E7/IGF2BP2/m6A MYC/糖酵解軸可能在宮頸癌的發病機制中起關鍵作用,這表明靶向HPV E6/E7及其下游通路可能是治療該癌癥患者的一個有吸引力的治療選擇。N6-甲基腺苷(m6A)異常修飾影響宮頸癌細胞的發生、發展和預后,異常的m6A調節因子可能確定為治療宮頸癌新的藥物靶點。

3 RNA靶向m6A在宮頸癌治療中的潛力

隨著表觀遺傳學和分子生物學的發展,新型m6A甲基化修飾越來越受到關注。近年來,許多研究說明了m6A可能與lncRNA一起參與宮頸癌的發病機制。Wang等[26]研究發現與鄰近正常組織相比,宮頸癌組織中GAS5-AS1的表達顯著降低,且GAS5-AS1的下調與晚期FIGO分期、遠處轉移、淋巴轉移和不良預后顯著相關。GAS5-AS1在體外顯著降低宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲,在體內顯著抑制宮頸癌的致瘤性和轉移;GAS5-AS1與腫瘤抑制因子GAS5相互作用,并通過與RNA去甲基化酶ALKBH5相互作用和減少GAS5 N6甲基腺苷(m6A)修飾來增加其穩定性,m6A介導的GAS5 RNA降解依賴于m6A讀取器蛋白YTHDF2依賴的途徑;因此研究者發現了宮頸癌癌變和轉移中表觀遺傳學改變的一個重要機制。ZFAS1在宮頸癌組織中顯著上調,ZFAS1的升高與晚期FIGO分期、淋巴結和遠處轉移相關,也表明宮頸癌患者的總體生存率較低[27]。Yang等[27]研究發現ZFAS1在體外促進宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲,在體內促進腫瘤生長和轉移;ZAFS1隔離了miR-647,這種RNA-RNA相互作用受METLL3介導的m6A修飾的調節。以上研究說明ZFAS1及其m6A修飾在宮頸癌細胞中的功能作用,并表明ZFAS1可能是宮頸癌治療的一個有希望的靶點。研究發現lncRNA KCNMB2-AS1在宮頸癌中顯著過度表達,并與不良預后相關,KCNMB2-AS1的缺失顯著抑制宮頸癌細胞增殖并誘導凋亡[28]。體內異種移植模型顯示敲除KCNMB2-AS1明顯延遲腫瘤生長; KCNMB2-AS1作為競爭性內源性RNA大量海綿狀miR-130b-5p和miR-4294,導致IGF2BP3的上調,IGF2BP3是宮頸癌中一個已被證實的癌基因,其能夠通過KCNMB2-AS1上的3個N6甲基腺苷(m6A)修飾位點結合KCNMB2-AS1,其中IGF2BP3充當m6A“讀取器”并穩定KCNMB2-AS1;因此,KCNMB2-AS1和IGF2BP3形成了一個正調節回路,擴大了KCNMB2-AS1在宮頸癌中的致瘤作用[28]。FOXD2-AS1在宮頸癌細胞和組織中的表達顯著上調,這與不良預后密切相關[29]。在功能方面,功能獲得和功能喪失分析顯示FOXD2-AS1促進宮頸癌細胞的遷移和增殖,FOXD2-AS1沉默抑制了體內腫瘤的生長;m6A甲基轉移酶-甲基轉移酶樣3(METTL3)增強了FOXD2-AS1的穩定性并維持其表達;FOXD2-AS1將賴氨酸特異性去甲基酶1(LSD1)招募到p21的啟動子區域,以抑制其轉錄豐度;以上研究說明了METTL3/FOXD2-AS1通過m6A依賴方式加速宮頸癌的進展[29]。研究表明miR-193b較低的表達與更晚期的宮頸癌分期和更深的間質浸潤密切相關[30]。miR-193b是一種腫瘤抑制因子,受宮頸腫瘤中m6A甲基化的調節,METTL3以m6A依賴的方式調節miR-193b成熟過程,通過CCND1靶向在體內和體外重新引入miR-193b可顯著抑制宮頸癌細胞的增殖,說明m6A相關的miR-193b下調通過靶向CCND1促進宮頸癌的侵襲性[30]。Ji等[31]研究發現新的m6A修飾的circRNA(circARHGAP12,hsa_circ_0000231)在宮頸癌組織和細胞中上調,circARHGAP12的m6A修飾可以放大其富集;實驗表明circARHGAP12在體內外均促進了宮頸癌的進展,MeRIP-Seq表明FOXM1 mRNA中有一個顯著的m6A位點,CircARHGAP12與m6A讀取器IGF2BP2相互作用與FOXM1 mRNA結合,從而加速FOXM1 mRNA的穩定性;該研究說明circARHGAP12通過m6A依賴IGF2BP2/FOXM1途徑在宮頸癌進展中發揮致癌作用。Chen等[32]研究了hsa_circ_0000069(circ0000069)對宮頸癌的促瘤作用及其作用機制,發現circ0000069在宮頸癌細胞和組織中上調,N6-甲基腺苷(m6A)修飾保持了circ0000069的穩定性,circ0000069促進頸癌細胞增殖和遷移;miR-4426特異性結合circ0000069并介導其在宮頸癌發育中的功能,circ0000069部分上調是由于m6A修飾,其通過宮頸癌中的海綿狀miR-4426促進細胞增殖和遷移。piRNA-14633在宮頸癌組織和細胞中高表達,piRNA-14633模擬物(piRNA-14633過度表達)促進CaSki細胞和SiHa細胞的存活、增殖、遷移和侵襲,piRNA-14633模擬增加了m6A RNA甲基化水平和METTL14 mRNA穩定性;METTL14是piRNA-14633的定向靶基因,用siRNA敲除METTL14可減弱宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲;piRNA-14633增加了CYP1B1的表達而METTL14的沉默削弱了其表達。piRNA過度表達對METTL14表達的影響具有濃度依賴性,體內實驗結果表明piRNA-14633促進宮頸腫瘤生長,說明piRNA-14633通過METTL14/CYP1B1信號軸促進宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲,突出了piRNA-14633在宮頸癌中的重要作用[33]。以上研究說明了m6A修飾和RNA在宮頸癌中的共同作用影響了宮頸癌細胞的增殖、侵襲、遷移,因此我們可以通過以上的結果進行進一步研究,通過調節m6A和RNA之間相互作用的途徑來阻礙宮頸癌的發生和發展。

綜上,m6A書寫器、擦除器和讀取器的表達水平調節人類癌細胞中的RNA甲基化情況,可逆的RNA甲基化通過對轉錄、剪接、mRNA穩定性和翻譯速率的影響,調節癌細胞的基本特征[12]。在宮頸癌中,m6A修飾促進了癌細胞的增殖、侵襲、遷移以及腫瘤的惡行性。另外,研究應該集中在m6A甲基轉移酶METTL3、METTL14和METTL16及其伙伴蛋白、去甲基酶FTO和ALKBH5以及m6A閱讀器YTHDF1-3、YTHDC1-2和IGF2BP1-3的致癌作用機制上,以便為靶向治療提供新的、更具體和有效的策略[11]。另外,m6A調節因子在腫瘤免疫治療和免疫逃避中被廣泛研究。腫瘤免疫治療是最有前途的治療策略,m6A修飾介導的免疫侵襲成為婦科腫瘤發病機制和預后研究的熱點[34]。然而,m6A修飾在婦科腫瘤中介導的免疫侵襲的研究仍處于起步階段,在未來的研究中,m6A修飾有望在這一領域取得新的突破[34]。因此,把m6A修飾酶或者靶向的RNA作為研究靶點,阻斷或者沉默其研究靶點將是宮頸癌有力的潛在治療策略。我們相信在不久的將來,越來越多的新型、特異、有效的m6A修飾抑制劑和激活劑將被開發并批準用于臨床。