四類蟲草誘導人胃癌細胞BGC-823衰老的轉錄組預測分析

摘"" 要：基于轉錄組測序技術預測四類常見蟲草對人胃癌細胞BGC-823衰老的誘導。4mg/mL蟬花蟲草（CH組）、冬蟲夏草（DX組）、普通蛹蟲草（PT組）及功能性蛹蟲草（XG組）處理人胃癌細胞BGC-823 24h，對細胞衰老信號途徑產生的差異表達基因（Plt;0.05）進行表達模式聚類分析，利用STRING數據庫構建差異表達基因的蛋白質相互作用網絡，獲得hub基因及其共表達網絡。結果顯示，衰老信號途徑上，PT組與XG組的差異表達基因主要為下調表達，CH組與DX組以上調為主。4個實驗組共有9個差異表達基因，均為下調表達。ATM 和CCND1是4個實驗組的共有hub基因，表達量均被顯著抑制（Plt;0.05）。CH組、PT組與XG組hub基因主要參與細胞周期G1/S期轉換的調控，DX組則與IL-6介導的細胞衰老有關。四類蟲草可通過不同調控機制誘導人胃癌細胞BGC-823衰老的發生。

關 鍵 詞：蟲草; 轉錄組; 細胞衰老信號途徑; 人胃癌細胞BGC-823

中圖分類號：R285.5""" 文獻標志碼：A

Transcriptome prediction analysis of four Cordyceps species inducing senescence in human gastric cancer BGC-823 cells

Abstract： Transcriptome sequencing technology was used to predict the senescence induction of four common cordyceps on human gastric cancer cell BGC-823. Human gastric cancer cells BGC-823 were treated with 4mg/mL Cordyceps cicandae（CH group）， Cordyceps sinensis（DX group）， Cordyceps militaris（PT group）and functional Cordyceps militaris（XG group）for 24h. After transcriptome sequencing， expression pattern cluster analysis was performed on differentially expressed genes（DEGs）（Plt;0.05）generated by cell senescence signaling pathway. The protein interaction network of DEGs was constructed using STRING database to obtain hub genes and their co-expression network. In the cellular senescence signal pathway， the DEGs in PT group and XG group were mainly down-regulated， while those in CH group and DX group were mainly up-regulated. A total of 9 DEGs were identified in the 4 experimental groups， all of which were down-regulated.ATM and CCND1 were the common hub genes in the four experimental groups，and the expression levels of ATM and CCND1 were significantly inhibited（Plt;0.05）.The hub genes of CH group，PT group and XG group were mainly involved in the regulation of G1/S phase transition of cell cycle， and the hub genes of DX group were related to IL-6 mediated cell senescence.Four classes of Cordyceps can induce the senescence of human gastric cancer cell BGC-823 through different regulatory mechanisms.

Key words： Cordyceps; transcriptome; cellular senescence signaling pathway; human gastric cancer BGC-823 cell

細胞衰老（cellular senescence）是一種不可逆的細胞周期停滯狀態。正常情況下，衰老的誘導能夠阻止老齡細胞或DNA受損細胞的復制，使其退出細胞周期，維護機體健康狀態［1］；腫瘤細胞的高復制特性往往增加基因組的不穩定性、細胞周期G1/S期檢查點喪失及DNA修復缺陷等風險，及時啟動衰老程序可以有效阻止細胞的惡化，是機體重要的抗癌機制［2］。合理利用細胞衰老的抗增殖作用達到治療癌癥的效果，被稱之為促衰老療法。研究顯示，大量的抗癌干預手段，如順鉑、環磷酰胺、多西他賽等藥物治療和放射療法等，均可以通過觸發基因毒性應激、有絲分裂信號的過度激活或氧化應激等途徑誘導癌細胞衰老［35］。同時，紫杉醇、姜黃素、黃芩苷等中草藥活性成分均被證實可通過抑制端粒酶活性［6］、引發DNA損傷［7］、促進細胞周期停滯［8］、激活或滅活癌基因［9］等途徑誘導細胞衰老，為癌癥治療提供新的治療策略和視角。

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，而我國是東南亞國家胃癌的高風險地區。蟲草在我國具有較為悠久的食用和醫藥應用歷史，蟬花蟲草（Cordyceps cicandae）、冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）及蛹蟲草（Cordyceps militaris）是我國蟲草產業商業化程度最高的3個蟲草品系?！肮δ苄杂枷x草”是本課題組培育的特殊蛹蟲草品種（專利號：ZL201310728874.4）。長期研究結果顯示，三類蟲草具有非常相似的生物學功能，如免疫調節、抗炎和抗癌等。蟲草素可以觸發人食管癌細胞ECA8細胞周期G2/M期停滯，誘導細胞衰老［10］。蟬花蟲草破壁孢子粉可通過阻斷G2/M期轉換抑制人肺癌細胞A549的增殖［11］；冬蟲夏草多糖可通過觸發S期停滯抑制人宮頸癌細胞Hela增殖［12］。實驗室前期研究結果顯示，蟬花蟲草、冬蟲夏草、普通蛹蟲草和功能性蛹蟲草對人胃癌細胞BGC-823增殖活性均具有穩定的抑制作用［13］，但其主要作用機制尚不明確。因此，本研究基于實驗室前期轉錄組數據庫信息，對比分析4類蟲草對人胃癌細胞BGC-823衰老信號途徑的影響，為各蟲草抗癌活性的合理挖掘和應用提供更加全面的參考。

1 材料與方法

1.1 轉錄組原始數據來源

蟬花蟲草、普通蛹蟲草和功能性蛹蟲草子實體均由遼寧省功能性蛹蟲草重點實驗室栽培提供，冬蟲夏草購自青海。采用4mg/mL各蟲草水提取物處理5×105個/mL人胃癌細胞BGC-823 24h，責成廣州基迪奧生物科技有限公司進行測序分析，獲取轉錄組原始數據［13］。

1.2 實驗方法

1.2.1 差異表達基因的對比分析

參考對照組（CK組）基因表達量，以Plt;0.05作為篩選標準，調取蟬花蟲草處理組（CH組）、冬蟲夏草處理組（DX組）、普通蛹蟲草處理組（PT組）及功能性蛹蟲草處理組（XG組）細胞衰老信號途徑的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGS），比對各實驗組間共有和特有的DEGs，根據各組DEGs的表達量進行模式聚類分析，比對具有顯著性profile（Plt;0.05）中的DEGs表達情況。

1.2.2 蛋白質相互作用的分析

基于STRING數據庫（https：//cn.string-db.org/），以置信度大于4為閾值，設置“no more than 20 interactors ”得到DEGs蛋白質相互作用網絡（protein-protein interaction，PPI）。使用Cytoscape 3.9.1 軟件的MCODE插件對上述PPI網絡圖進行模塊劃分（Node Score Cutoff：0.2，K-Core：2）。

1.2.3 Hub基因的篩選與功能預測

應用CytoHubba插件，利用MCC算法，將各實驗組degree排名前10的DEGs確定為hub基因［14］，通過GeneMANIA（http：//www.genemania.org/）構建hub基因的共表達網絡，并進行功能預測。

2 結果與分析

2.1 差異表達基因的分析

如圖1（a）所示，CH組DEGs最少，為43個；PT組最多，為80個，PT組與XG組主要為下調DEGs，CH組與DX組則以上調DEGs為主。4個實驗組共有9個下調DEGs。其中CH組和DX組共有上調DEGs數量最多，為21個，PT組和XG組共有下調DEGs數量最多，為54個。PT組和XG組DEGs表達量改變模式更為相似（圖2（a））。各實驗組DEGs的表達變化趨勢共聚類形成20個profiles，具有顯著性的profile共3個（Plt;0.05）。profile 1和profile 2 DEGs的表達量變化趨勢均為下調（圖2（b））。profile 16中SIRT1，FoxO3，GADD45A，SERPINE1，IL6，IL1A，PIK3R1和LIN54等8個DEGs在CH組和DX組為上調表達模式，在 PT組和XG組則為下調表達模式。

2.2 DEGs之間的互作關系

CH組DEGs的PPI網絡聚類為3個基因簇；DX組為4個；PT組和XG組均為7個（圖3），其中，各組MCODE 1為Score最高的基因簇，CH組MCODE 1中ATM，KRAS，CCND1等基因主要參與細胞周期檢查點的調節相關功能；而DX組中CCND1，KRAS，ATM等基因主要與激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性有關。PT組和XG組MCODE 1中基因基本相同，主要與細胞周期G1/S轉換調控有關。

2.3 Hub基因的篩選與功能預測

如表1所示，ATM 和CCND1為4個實驗組在衰老信號通路上的共有hub基因，表達量均被顯著抑制（Plt;0.05），CH組與DX組共有8個hub基因，PT組與XG組共有8個hub基因，除CDKN2A外，均為下調表達狀態。功能預測結果表明，CH組、PT組與XG組hub基因的功能富集基本一致，主要參與細胞周期G1/S期轉換的調控，DX組主要參與細胞對IL-6的反應和細胞衰老的調控（表2）。

3 討 論

SIRT1是一種NAD+依賴的去乙酰酶，參與細胞增殖、細胞周期和耐藥等生物學過程，胃癌組織中往往呈低表達狀態［15］。過表達SIRT1可誘導人胃癌細胞BGC-823細胞周期G1期停滯，使細胞出現增殖抑制［16］。抑癌基因FoxO3過表達可明顯抑制人胃癌細胞SNU638的增殖［17］，SIRT1介導的FoxO3a去乙酰化可正向調節GADD45A 的表達［18］，FoxO3a敲低后，人胚腎細胞HEK293T的GADD45A的表達量顯著降低［19］。GADD45a的上調會抑制人膀胱癌細胞293T生長和增殖，誘導G1/M 和S期停滯。因此，蟬花蟲草和冬蟲夏草可能通過促進SIRT1-FoxO3-GADD45A相關蛋白表達，抑制人胃癌細胞BGC-823增殖，誘導細胞周期停滯的發生。

ATM和CCND1為4個實驗組共有的hub基因，表達量均下調。ATM是DNA損傷修復過程中的關鍵蛋白激酶，主要被DNA的雙鏈斷裂激活，而DNA損傷積累是細胞衰老的主要原因。CCND1是一種重要的細胞周期調節蛋白，其主要功能是通過縮短G1期促進細胞增殖。過表達的CCND1會促進人胃癌細胞BGC-823增殖，敲低CCND1顯著減少G1期和S期的細胞數量［20］。在細胞周期調控中，CCND1-CDK4/6-Rb信號通路是調節細胞G1到S期過渡的關鍵。當受到有絲分裂信號刺激時，CCND1 與CDK4/6形成活性復合物，以驅動G1/S期轉換。而CDK4/6抑制劑CDKN1A和CDKN2A則會阻止E2F2的釋放，使細胞周期停滯在G1期。CDKN1A和CDKN2A是衰老細胞中常見的標志物，CDKN1A過表達會抑制人胃癌細胞BGC-823增殖［21］。因此，四類蟲草可能通過抑制CCND1誘導人胃癌細胞G1/S期停滯，從而引發細胞衰老。

DX組hub基因IL-6，CXCL8和RELA表現為上調狀態。衰老相關的分泌表型是衰老細胞的一個典型特征。在持續性DNA損傷信號建立后，衰老細胞分泌一系列可溶性因子，包括IL-6和CXCL8等炎癥因子。這些炎癥因子分泌、啟動和維持需要ATM和CHK2等DNA 損傷應答蛋白的調控。X射線導致的DNA損傷，可以增加人成纖維細胞HCA-2 IL-6和CXCL8的分泌［22］；ATM的耗竭使ATM-人成纖維細胞HCA 2的IL6和CXCL8分泌減少近70%。DX組hub基因功能富集結果顯示，冬蟲夏草主要參與調節細胞對IL-6的反應和細胞衰老等過程。綜上，冬蟲夏草可能通過調節細胞IL-6等炎癥因子的表達，促進人胃癌細胞BGC-823衰老的發生。

4 結" 論

四類蟲草均可能通過影響細胞DNA損傷的修復誘導人胃癌細胞衰老的發生。此外，蟬花蟲草、蛹蟲草與功能性蛹蟲草發揮衰老誘導活性與上調細胞周期G1/S期阻滯關系密切，而冬蟲夏草主要參與了IL-6相關的衰老誘導，其中具體的抗腫瘤活機制，仍需要通過更深入的實驗加以驗證。

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