纖維素降解菌株性能優化及其資源化利用

摘"" 要：纖維素是自然界中儲量最豐富的可再生資源之一，但由于其分子結構復雜，通常難以被自然降解，這導致纖維素的綜合利用效率低下，造成資源浪費。為應對日益嚴峻的能源和環境問題，相比于傳統的物理和化學降解方法，利用微生物技術篩選出具有高酶活性和強降解能力的纖維素降解菌進行生物降解，成為實現纖維素資源化的重要途徑。從纖維素的結構、降解方法及機制、纖維素降解菌的種類及菌株降解性能的提升等方面，概述了纖維素降解菌的研究進展。針對目前降解菌株廣泛應用中的技術瓶頸，提出了解決方案和研究重點，為纖維素降解菌的探索與應用提供了新的方向和理論依據。

關 鍵 詞：纖維素降解菌； 纖維素分子； 降解方法； 酶活力； 復合菌系

中圖分類號：O343.1;O341""" 文獻標志碼：A

Optimization of cellulose-degrading bacterial strain performance and its resource utilization

Abstract： Cellulose is one of the most abundant renewable resources in nature， but due to its complex molecular structure， it is usually difficult to be naturally degraded， which leads to the inefficiency of comprehensive utilization of cellulose， resulting in the waste of resources. In order to cope with the increasingly serious energy and environmental problems， compared with the traditional physical and chemical degradation methods， the use of microbial technolorgy" to screen cellulose-degrading bacteria with high enzyme activity and strong degradation ability for biodegradation has become an important way to realize cellulose resourcefulness. In this paper， the research progress of cellulose degrading bacteria is outlined from the structure of cellulose， degradation methods and mechanisms， species of cellulose degrading bacteria， and the enhancement of the degradation performance of the strains. Solutions and research priorities are proposed for the technical bottlenecks in the current widespread application of degrading bacteria strains， providing a new direction and theoretical basis for the exploration and application of cellulose degrading bacteria.

Key words： cellulose-degrading bacteria; cellulose molecules; degradation methods; enzyme activity; composite systems

纖維素是自然界存在最廣泛的可再生能源，可廣泛用于食品、畜牧業、醫藥、紡織業、生物能源等領域，但如此豐富的資源利用率卻很低。據《全國農作物秸稈綜合利用情況報告》顯示［1］，2021年我國農業秸稈產量約為7.34億t，其中0.87億t的秸稈未被利用，占總秸稈資源的11.9%。在我國的工農業生產中，每年可以產生幾百萬噸的植物秸稈和纖維素廢棄物，秸稈中纖維素與半纖維素及木質素等物質所組成的復雜空間結構使其通常很難被自然降解，導致纖維素資源很難有效地被分解利用，有很大一部分被燒毀或者廢棄，造成纖維素資源的浪費。如何高效合理地利用纖維素資源是當前社會廣為關注的一個熱點問題。采用生物方法降解纖維素可以使纖維素酶在纖維素分子結構內部水解糖苷鍵，破壞其復雜的內部結構，從而達到降解效果。纖維素酶主要靠纖維素降解菌株產生，因而如何選擇一種具有較好活性且具有可高產纖維素酶的菌株也是其中的關鍵。本文綜述了纖維素降解菌的研究狀況。

1 纖維素概述

1.1 纖維素的基本結構

纖維素分子是由多個D-葡萄糖組成、通過β-1，4糖苷鍵相連的線性長鏈聚合物，主要包括碳、氫、氧3種元素，其中碳和氧2種元素含量較高，其分子式為（C6H10O5）n，n代表葡萄糖苷的聚合程度。纖維素的結構穩定性與D-葡萄糖的聚合程度有很大關系，D-葡萄糖的聚合程度越高，n越大，其分子鏈越長，結構越緊密，化學性能越穩定。

目前，國內外學者將纖維素的結構理論命名為結晶區無定形區兩相共存理論［2］，該理論的核心是：纖維素分子內部及分子之間存在大量的氫鍵，這些氫鍵使纖維素分子易于相互結合，形成一種微晶或膠束狀結構，即由多個大分子高度聚合而成的超分子結構［3］；每一大類大分子之間都存在著各種形態的結合，其中既有高度有序的結晶區，也有較疏松的無定形區，甚至有一些聚集成一團，比較規整地排列，構成結晶區，而一些松散堆積而成的無定形區，其結晶性很差，大部分區域是裸露的，局部是無序松散的，這2個部分區域在纖維素結構中交替出現，沒有明確的邊界［4］。纖維素分子內形成的氫鍵導致各個D-葡萄糖小分子之間的β-1，4糖苷鍵不能旋轉，同時由于纖維素結構中存在的結晶區-無定形區交替連接的特殊結構，加強了纖維素分子鏈的線性完整性和剛性，極大地增強了纖維素結構的穩定性［5］。纖維素在室溫下既不能溶解于水，也不能溶解于酸、堿、乙醇等普通有機溶劑，分子內部大量的親水官能團也阻礙纖維素降解反應的進行。同時在纖維素結晶區，由于其分子結構有序，各原子間的相對位置穩定不變，內部各分子結合非常緊密，形成相對牢固的總體結構，阻擋一些大分子（包括酶分子和水分子）進入其分子內部，從而造成了纖維素酶解的困難，但是無定形區的纖維結晶性較差，多數為外露，局部為無序疏松，易被降解［2］。此外，結晶區到無定形區并沒有嚴格的邊界，而且在二者的過渡地帶，還會出現諸如微細纖維結、表面微孔等多種不規則結構，能為纖維素酶等大分子提供通道，從而在一定程度上促進了纖維素的降解。

1.2 纖維素降解方法

纖維素在人類生產活動中起著重要的作用［6］。纖維素內部分子結構的復雜性導致其資源利用率低，若將其直接焚燒，會造成嚴重的空氣污染，危害環境。因此，高效利用纖維素是目前研究的熱點。當前對纖維素的降解方法有物理、化學和生物方法3種（表1），與費時費力、不環保、成本還高的物理機械降解和化學降解相比，生物方法降解無疑是最高效、最節省、環保的方法，因而如何高效地利用具有降解纖維素能力和產纖維素酶的菌株這一問題受到科學界越來越多的重視。

1.3 纖維素降解機理

自1906年Seilliere在蝸牛的消化液中發現纖維素酶后，關于纖維素酶的研究與應用引起了許多學者的重視。纖維素酶是可降解纖維素的一種復雜酶系的總稱，按其催化作用可分為三大類［15］：1）內切β-1，4`葡聚糖酶，隨機“切割”纖維素分子非結晶區的β-1，4-糖苷鍵，產生許多具有非還原末端的纖維素短鏈［16］；2）外切β-1，4-葡聚糖酶，“切割”纖維素短鏈分子末端β-1，4-糖苷鍵，生成單個的纖維二糖分子［16］；3）β-1，4-葡萄糖苷酶，切割纖維二糖之間的β-1，4-糖苷鍵，分解為單個的葡萄糖分子［17］。

纖維素的酶解是一個非常復雜的過程，自20世紀以來，國內外學者對其進行了大量的研究，提出了C1-CX、順序作用、協同作用三大假說［18］。目前協同作用假說得到了社會各學者普遍認同，即3種酶協同作用將長鏈纖維素完全降解為單個的葡萄糖，其主要原理：首先，內切β-1，4-葡聚糖酶作用于線性長鏈的纖維素分子無定形區，將長鏈纖維素分子“切割”成不同長度的短鏈纖維素分子［19］；然后，在外切β-1，4-葡聚糖酶的作用下，短鏈纖維素分子被“切割”成纖維二糖［16］；最后，經β-1，4-葡萄糖苷酶識別并“切割”，將纖維二糖徹底水解為單個的葡萄糖分子。在整個酶解反應過程中，作為限速酶的β-1，4-葡萄糖苷酶起著關鍵作用，可以有效去除反應過程中酶解產物的抑制效應，加速酶促反應的進行［2021］。

2 纖維素降解菌的種類

纖維素降解菌是一類能夠以纖維素為唯一碳源，進行有氧或無氧呼吸作用的特殊微生物，在自然界中廣泛存在，如土壤［22］、腐木［23］、動物胃腸道及糞便等［5，24］，纖維素降解菌通過分泌酶類將纖維素分解成單糖、寡糖或寡聚葡萄糖，再經代謝產生多種有機酸、維生素等物質，從而對環境起到凈化作用［25］。自然界存在著豐富的纖維素酶資源，細菌、真菌和放線菌都可以產生纖維素酶，從20世紀60年代開始，已發現了上千個產纖維素酶菌種，涉及53個屬［26］。

2.1 細菌

細菌的大小通常在0.5～3.0μm，其比表面積較大，便于物質快速地進入細胞［25］。在降解纖維素的菌群中，細菌具有許多優勢：數量比其他菌群多、繁殖周期短、對環境的適應能力強，部分芽孢桿菌能產生較厚的孢子，具有抗高溫、輻射及很強的抗菌能力；在低氧、弱堿或中性環境下，某些纖維素降解細菌仍能分泌高活力纖維素酶［27］。除了上述的優勢，其不足之處在于細菌所分泌的纖維素酶通常為胞內酶，生成的胞外酶比較少，純化成本比較高。雅男［18］篩選出了1株具有纖維素降解能力、產芽孢且好氧的類芽孢桿菌屬菌株；宋雨等［28］在山西老陳醋源中篩選出3株不同類別的芽胞桿菌屬細菌，通過多種菌株復配獲得一組秸稈纖維素高效降解復合菌系，對小麥秸稈的降解率最高可達27.63%。另有研究表明，假單胞菌屬［5］、枯草桿菌、地衣球菌屬［29］、其諾卡氏菌［30］、假單胞桿菌［31］和瘤胃球菌等對纖維素也都有較好的降解作用。

2.2 真菌

真菌是工業中常用來制備纖維素酶制劑的菌株，它具有分泌纖維素酶系相對齊全、產酶活性更高的優勢。真菌通過產生胞外酶和菌絲“機械穿插作用”，降解木質素、半纖維素和纖維素等難降解的有機物［32］。真菌也具有較明顯的缺點：所產纖維素酶多為酸性，對環境的耐受性弱；由于真菌本身的喜溫特性，其生長和產酶能力對環境適應性差。馮欣欣等［23］以新疆寒冷地區腐木為試驗材料篩選出4株對秸稈酵解率在40%以上的優質真菌菌株。于慧娟和郭夏麗［33］從菜田土、小草根際土、蠶糞及森林土樣中分離純化出 4 株高效秸稈降解真菌，其10 d內對秸稈降解率皆可達47%，且菌株 z-5 酶系種類齊全［33］。同時，真菌還是自然界中纖維素物質的主要降解者，其許多菌屬作為工業化生產的酶源被廣泛應用［34］。

2.3 放線菌

放線菌通過增強纖維素的水溶性和菌絲的穿透性使纖維素分子結構發生變化，從而有效地降解纖維素。放線菌具有更強的耐熱、耐酸性；在極端環境下，與芽孢桿菌相似，放線菌能夠產生孢子來抵御嚴酷的環境繼而發揮作用［15］。與其他菌群相比，放線菌具有特殊的代謝途徑，其分泌胞外酶的能力格外突出［1］。此外，放線菌的缺點也很明顯，菌株生長緩慢，降解纖維素和木質素的能力不如其他菌群。張晶等［35］在森林土壤和秸稈堆肥中篩選獲得1株婁徹氏鏈霉菌，其能同時降解半纖維素、纖維素和木質素，在7 d內對秸稈的降解率可達29.23%。

3 菌株降解性能的提升

3.1 誘變選育

從自然界直接分離篩選出來的纖維素降解菌株產酶活力一般會偏低，通常不能適應生產需要［5］，需要采用人為的方法來誘導干預，使其發生突變，優化其產酶能力，從而篩選出符合工業化要求的菌株。誘變能夠極大地提高菌株的降解性能，誘變選育是菌株在培養的過程中經各種誘變條件的干預，從而獲得具有降解性能優良的優勢菌株。然而，由于誘變具有不確定性，同時經誘變后的生物體所顯現的效果不顯著等原因，誘變的效果不一定能夠達到預期的目的。因此，需要采用多種方法來獲得理想的降解性能更好的菌株［36］。菌株降解性能的提升方法通常有物理誘變、化學誘變及利用基因工程等方法。

3.1.1 物理誘變

物理誘變是利用物理誘變劑，在一定程度上改變菌株的遺傳物質，以獲得具有較大產酶活力的菌種的方法［37］。研究表明，利用紫外線等物理誘變劑對菌株進行處理，會使菌株內部能量發生遷移或在DNA復制過程中引起堿基對的變化［37］，通過能量的變化和菌株遺傳物質的改變來影響菌株的產酶能力，最終提升菌株降解性能［36］。張麗敏等［38］利用12C6+離子束輻照對枯草芽孢桿菌進行誘變處理，結果表明經處理后的菌株較原始菌株對纖維素降解率提高了17.75%；張艷萍等［39］通過紫外線誘變方法對纖維素降解菌長枝木霉進行誘變，與未經誘變的初始菌株相比，誘變后的菌株水解圈直徑/菌落直徑值增大，纖維素降解率及半纖維素降解率分別提高了數倍，且經電鏡掃描發現，誘變后的菌株對玉米秸稈的降解程度更徹底。

3.1.2 化學誘變

化學誘變是利用化學誘變劑引起菌株DNA配對時堿基對的轉換或錯配，從而發生遺傳變異的方法。化學誘變劑通過作用于菌株DNA上的堿基對，影響菌株的生長和代謝活動，使菌株的降解能力進一步提升［37］。常見的化學誘變劑有C4HO4S、HNO2，C3H8O3S，LiCl等［36］。王霞等［40］從秸稈還田土壤中篩選到一株產酶活性較高的地衣芽孢桿菌菌株，通過HNO2誘變法對菌株進行處理，誘變后的菌株較原始菌株相比，產酶能力提高了67.5%，且具有更良好的耐pH和溫度特性。

3.1.3 基因工程

由于生物技術的蓬勃發展和纖維素酶工業化的需求，與常規物理、化學誘變選育方法相比，利用基因工程通過定向進化和分子改造獲得具有高效降解效率的重組菌株的方法逐漸引起國內外學者的關注［41］。田偉等［42］克隆了菌株T2的內切酶基因并對該基因進行了結構域分析，同時構建了表達載體p28-egB并將其轉化至感受態細胞中進行表達，最終在E.coli BL21中成功表達了菌株Bacillus subtilis的內切酶基因。

3.2 菌株產酶條件優化

目前，影響菌株產酶活力的因素有很多，如培養溫度、pH、接種量、培養基成分等，最佳的產酶條件能夠實現菌株降解性能的進一步提升。

3.2.1 培養基成分對菌株產酶的影響

1）碳源、氮源

在發酵過程中，碳源和氮源的差異是影響纖維素降解菌產酶條件的一個重要因素。適合纖維素降解菌的碳、氮源既可以提高菌株的生長量，又能夠提高產酶效率［18］；李爭明等［43］運用正交實驗對纖維素酶降解菌進行發酵產酶條件優化，當牛肉膏添加量為0.6%時，濾紙酶、內切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活性都有顯著的提高。彭永妍等［44］利用不同碳、氮源對糞產堿菌S-04產纖維素酶的影響進行了研究，以CMC-Na作為碳源時，其CMCase和FPA活性均表現出良好的穩定性，用牛肉膏作氮源時，菌株產2種纖維素酶組分的活性均為最高。氮源包括有機氮源和無機氮源，適宜不同菌株生長的最佳氮源存在差異，實驗結果顯示，相較于無機氮源，有機氮源通常更適用于菌株的培養［18］。張麗青等［45］通過對有機氮和無機氮等6種不同氮源進行菌株發酵產酶試驗，確定當蛋白胨作為氮源時，菌株產CMCase活性最高。

2）金屬離子

物理、化學和生物等因子能夠改變酶的空間結構，進而對反應過程產生影響；除此之外，酶在參與反應過程中也會受到金屬離子的影響，金屬離子通過對底物濃度的調控，可以在反應過程中改變自身的化合價來調節氧化還原反應，進而影響酶的催化作用［46］。金屬離子可作為一種激活劑添加在菌株的生長發酵過程中，從而進一步提高菌株產酶活力。楊耀剛［12］通過在纖維素降解細菌液體發酵產酶實驗中添加不同含量的金屬離子，發現不同的金屬離子在酶促反應中發揮著不同的作用。金屬離子能參與纖維素降解酶的組成，激發菌株產酶的活性。在菌株產酶的過程中，金屬離子除了是許多酶的激活劑外，還與反應條件及環境有關，比如在一定濃度下，金屬離子表現為激活作用，能夠促進酶促反應的進行；倘若濃度過高，則表現出相反作用［18］。李德瑩等［47］在對不同金屬離子影響纖維素酶活力的研究中發現，三價鐵離子和鈷離子能增強纖維素酶活力，而銅離子、鋅離子、錳離子會抑制纖維素酶活力。

3.2.2 不同培養條件對菌株產酶的影響

1）溫度

溫度對纖維素降解菌的生長量和產酶效率有著很大影響。適宜的溫度可以使菌株在最短的時間內快速繁殖，大大提高產纖維素酶的效率，同時酶活力也受溫度的影響［22］。酶促反應中，在一定范圍內培養溫度和酶促反應速率成正比［18］，當培養溫度過高時，會使纖維素降解菌大量死亡，使產酶效率降低，同時受高溫的影響也會導致菌株已產生的纖維素酶變性失活，從而大大減弱纖維素降解菌的降解能力；當培養溫度過低時，菌株的生長會受到低溫抑制，其生長量降低會導致菌株的產酶效率衰減。

2）pH

酸堿度是影響纖維素降解菌的生長及產酶能力的一個非常關鍵的因素，pH過高或過低，都會影響纖維素降解菌的產酶效率和降解性能［18］。pH的改變可能會使酶的氨基酸側鏈發生解離，使酶活性降低；pH還會影響菌株正常的生理功能，進而影響其酶分泌［4849］。王文凡等［14］從牛糞堆肥分離的解淀粉芽孢桿菌N5在pH為5.0～9.0時具有較高的酶活性，當初始pH為5.0時，CMC酶活性達到最高值176.74U/mL；當pH為7.5時，其濾紙酶活性最高，為26.67U/mL。

3）溶氧量

溶氧量主要體現在培養基的裝液量和搖床轉速上，適宜的氧濃度既能促進菌株的生長繁殖，又能提升菌株產酶能力［50］。當氧濃度過低時，菌株無法正常生長，因而產酶能力也會受到抑制。合理地調控好溶氧量是優化菌株產酶條件的關鍵［18］。崔登雪［51］對枯草芽胞桿菌進行分析，經影響因素設計實驗、實際實驗和最終擬合優化菌株發酵產酶條件等發現，當搖床轉速為237rpm時菌株產纖維素酶活力最高可達12.16U/mL，比最初產酶活力提高了6.85倍。在實際生產過程中，既要考慮固液比例和通風率的影響，還要注意各種環境因素對產酶活性的影響。

3.3 復合菌系的構建

由于纖維素是由多種酶協同降解，單個菌株分泌酶的能力有限，纖維素的降解需要多類酶的共同參與，構建微生物復合菌系可以更大程度地發揮菌株降解纖維素的效能［52］。多菌株協同降解纖維素的效果要比單一菌株高得多，這主要是因為在不同菌株共生過程中，存在著互補協同效應，產生的酶系比較協調，酶解產生的底物更加完備。因此，相較于單一菌株，復合菌系的產酶能力顯著提高［53］。修志君［53］對所篩選的無拮抗作用的菌株進行復合菌系的構建，結果表明復合菌系的產酶效率明顯高于單個菌株。李陽陽等［54］從水田表層土壤中分離出6種纖維素降解菌株，以6個菌株構建了7組復合菌系，其中3組復合菌系不僅具有良好的水稻秸稈降解能力，同時在提高土壤有機質、堿解N、速效P、速效K的含量等方面有著顯著的效果。

4 結" 語

纖維素降解菌作為一種廣泛的自然微生物資源，對于秸稈及許多纖維素廢棄物的降解有重要作用，在發展農業經濟上有很高的價值。雖然目前對于纖維素降解菌的研究技術已取得了長足的進步，優化菌株發酵條件、構建多種菌株復合菌系、添加金屬離子催化反應過程、經紫外輻照或其他化學試劑對菌株進行處理干預等，都可以使菌株降解纖維素的性能得到最大的發揮，但目前人們對纖維素降解菌的實驗仍大多停留在實驗室階段，在實際應用方面的經驗仍有較大缺失。

在菌株篩選方面，應針對不同地區的環境，針對性地篩選適宜的菌株，以確保菌株的降解性能得到最大程度的發揮，例如在鹽堿地地區和寒冷地區篩選出耐鹽堿、抗低溫的微生物。

在菌株性能優化方面，可通過研究秸稈還田條件下土壤微生物群落結構與功能的變化規律，探究纖維素降解對微生物群落結構和功能的影響；還可以調整復合菌系之間的不同組合比例，豐富構建復合菌系的多樣性，提高復合菌群的產酶能力，增強復合菌系的降解效果；通過利用基因工程等手段對纖維素降解菌進行工程設計，構建出多功能纖維素降解菌工程菌，最大限度地挖掘菌株的產酶能力。

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