生長激素對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響

蔣皓天,汪 攀,廖 彬,龔 勝,吳 南△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué),重慶 400016;2.中國科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院,重慶 400714;3.中國科學(xué)院大學(xué)重慶學(xué)院,重慶 400714;4.重慶市人民醫(yī)院神經(jīng)外科,重慶 401147)

生長激素(growth hormone,GH)型垂體腺瘤是垂體腺瘤中的常見類型,約占垂體腺瘤的20%～30%,其特征是GH持續(xù)分泌過多,并伴隨胰島素樣生長因子-1(IGF-1)升高,作用于全身組織,導(dǎo)致全身性神經(jīng)內(nèi)分泌綜合征[1-3]。兒童期與青春期患病由于GH分泌過多可導(dǎo)致骨骺閉合延遲、長骨生長加速,發(fā)展為巨人癥;成年后患病因骨骺已閉合則表現(xiàn)為面容改變及手足肢端增粗,發(fā)展為肢端肥大癥。研究表明,GH型垂體腺瘤患者相較于健康人群,患癌風(fēng)險(xiǎn)增加,尤其是結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、乳腺癌、前列腺癌和血液系統(tǒng)惡性腫瘤[4-8]。已有研究發(fā)現(xiàn),GH型垂體腺瘤可通過分泌GH影響乳腺癌血管生成、干性表達(dá)和化療耐藥性,并被證實(shí)在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用[9]。對于同時(shí)患有GH型垂體腺瘤的結(jié)腸癌患者,過量分泌的GH是否也會促進(jìn)結(jié)腸癌浸潤及轉(zhuǎn)移有待進(jìn)一步探討。據(jù)此,本研究擬通過體外研究探討GH對人結(jié)直腸腺癌LoVo細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響,同時(shí)分析GH在結(jié)腸癌中的調(diào)控及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與材料

人結(jié)直腸腺癌LoVo細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物所細(xì)胞庫;GH型垂體瘤GH3細(xì)胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司;重組人GH購自美國Pepro Tech公司;胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶消化液購自美國Gibco公司;基質(zhì)膠、Transwell小室購自美國Corning公司;GH ELISA檢測試劑盒購自美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

LoVo細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,于飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),貼壁生長。GH3細(xì)胞采用含15%馬血清和2.5%胎牛血清的F12培養(yǎng)基,于飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),貼壁生長。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用0.25%胰酶消化液消化,經(jīng)臺盼藍(lán)染色確定活細(xì)胞計(jì)數(shù)在95%以上,收集細(xì)胞。

1.2.2ELISA法檢測GH3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GH濃度

將GH3細(xì)胞培養(yǎng)72 h,收集上清液,500×g離心5 min去掉細(xì)胞碎片。標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本100 μL加入96孔板中,37 ℃孵育1 h;吸取上清液后加入100 μL檢測溶液A,37 ℃孵育1 h;洗板3次后,加入100 μL檢測溶液B,37 ℃孵育30 min;洗板3次后,加入90 μL 3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液,37 ℃避光顯色10～20 min,加入50 μL終止液后用酶標(biāo)儀檢測其450 nm處吸光度[A(450)]值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品A值,建立濃度-A值標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出GH3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的GH濃度。

1.2.3CCK-8法確定GH最佳干預(yù)濃度

取對數(shù)生長期的LoVo細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL,接種于96孔板,每孔加入100 μL細(xì)胞懸浮液。培養(yǎng)24 h后,分別加入0、50、200、400 ng/mL的重組人GH,每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后,每孔加入10 μL的CCK-8溶液,酶標(biāo)儀檢測A(450)值。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

取對數(shù)生長期LoVo細(xì)胞隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組,對照組中加入磷酸鹽緩沖液(PBS),實(shí)驗(yàn)組中加入最佳干預(yù)濃度的重組人GH,兩組細(xì)胞在相同條件下體外培養(yǎng)48 h,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以此分組。收集兩組細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS洗滌1次,離心棄上清液。加入預(yù)冷的無水乙醇,混勻,4 ℃固定過夜。加入預(yù)冷的PBS洗滌1次,離心棄上清液。加入100 μL RNaseA,混勻,37 ℃水浴30 min。加入400 μL的碘化丙啶(PI)溶液,混勻,4 ℃避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀在波長488 nm處進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲、遷移能力

細(xì)胞侵襲能力檢測：將基質(zhì)膠在4 ℃冰箱過夜融化。在冰上用預(yù)冷的槍頭吸取基質(zhì)膠加入冰上預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基中,充分混勻,稀釋基質(zhì)膠至1 mg/mL。取Transwell小室放入24孔板中,取稀釋的基質(zhì)膠100 μL加入小室上室,37 ℃孵育30 min,將小室四周多余的基質(zhì)膠洗出,繼續(xù)于37 ℃孵育,使基質(zhì)膠聚合成膠備用。收集對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞,用PBS和無血清培養(yǎng)基先后洗滌一次,細(xì)胞計(jì)數(shù)后,用無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液調(diào)整為2×105/mL。在下室中加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基,在上室中加入200 μL各組細(xì)胞懸液。培養(yǎng)24 h后,取出小室,PBS洗滌2次,甲醇固定15 min,結(jié)晶紫染色10 min,PBS洗滌,棉簽擦去小室中細(xì)胞,晾干后剪下小室的膜并用中性樹脂封片,鏡下觀察。細(xì)胞遷移能力檢測除不加基質(zhì)膠外,其余實(shí)驗(yàn)步驟同上述相同。

1.2.6Western blot檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)蛋白表達(dá)

收集對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞,提取總蛋白并用二奎琳甲酸(BCA)定量試劑盒測量蛋白濃度,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)1 h分離蛋白,再冰浴電轉(zhuǎn)2 h至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。10% 脫脂奶粉室溫封閉 2 h。洗滌膜,一抗β-actin(1∶2 000稀釋)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin,1∶1 000稀釋)、 N-鈣黏蛋白(N-cadherin,1∶1 000稀釋)、波形蛋白(Vimentin,1∶1 000稀釋)和蝸牛蛋白-1(Snail-1,1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜,洗滌膜,二抗(1∶2 500稀釋)室溫孵育2 h,洗滌膜,于化學(xué)發(fā)光成像分析儀中曝光,拍照。分析蛋白條帶灰度值,以β-actin為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 ELISA法檢測GH3細(xì)胞上清液中GH濃度

ELISA結(jié)果顯示GH3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GH濃度為(1 208±9)ng/mL。

2.2 GH對LoVo細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8法結(jié)果顯示0、50、200、400 ng/mL各濃度GH組A(450)值分別為(0.994±0.025)、(1.084±0.051)、(1.259±0.051)、(1.284±0.009)。與0 ng/mL GH組比較,各濃度GH組A(450)值均增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)GH濃度達(dá)到400 ng/mL GH后,與200 ng/mL GH組比較,A(450)值差異無明顯變化(P>0.05),因此選擇GH濃度200 ng/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),見圖1。

a：P<0.05,與0 ng/mL組比較。

2.3 GH對LoVo細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組比較,實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞周期從G1期向S期和G2轉(zhuǎn)變,G1期細(xì)胞比例下降,S期、G2期細(xì)胞比例升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

A：流式細(xì)胞圖;B：流式細(xì)胞術(shù)定量分析圖。a：P<0.05。

2.4 GH對人結(jié)直腸腺癌LoVo細(xì)胞侵襲和遷移的影響

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對照組穿膜細(xì)胞數(shù)量為(204±6)個(gè),實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)量為(385±6)個(gè),實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)量較對照組明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見圖3。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對照組穿膜細(xì)胞數(shù)量為(192±5)個(gè),實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)量為(447±9)個(gè),實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)量較對照組明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見圖4。

A：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)圖;B：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)定量分析圖。a：P<0.001。

A：Transwell遷移實(shí)驗(yàn)圖;B：Transwell遷移實(shí)驗(yàn)定量分析圖。a：P<0.001。

2.5 GH對LoVo細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照比較,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin和Snail-1表達(dá)水平上調(diào),E-cadherin表達(dá)水平下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.001),見圖5。

A：Western blot圖;B：Western blot定量分析圖。a：P<0.01;b：P<0.001。

3 討 論

垂體分泌GH可通過膜相關(guān)生長激素受體(GHR)直接或間接作用于外周組織[10]。研究發(fā)現(xiàn),GH不會直接導(dǎo)致正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變成惡性細(xì)胞,但它可以通過縮短細(xì)胞周期,加速DNA斷裂修復(fù)的時(shí)間來增加基因突變風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖、EMT和血管生成,并抑制細(xì)胞凋亡來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[6]。從動物模型到流行病學(xué)再到臨床研究,目前已有大量證據(jù)顯示GH與致癌相關(guān)。相反,通過對誘導(dǎo)GH缺乏或破壞GHR的動物模型的研究,以及對患有先天GHR信號傳導(dǎo)缺陷人群的調(diào)查發(fā)現(xiàn),GH缺乏可抑制惡性腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展[11-13]。侏儒綜合征(Laron綜合征)是一種GHR或受體后信號通路相關(guān)基因突變所致的先天性GH不敏感疾病[14]。在對637例Laron綜合征患者的長期隨訪中發(fā)現(xiàn),Laron綜合征患者中未發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤病例,而其親屬惡性腫瘤發(fā)病率>20%。與一般人群比較,Laron綜合征患者惡性腫瘤發(fā)病率明顯降低,先天性GH不敏感可抑制惡性腫瘤的發(fā)生[7]。結(jié)直腸癌是世界第三大常見癌癥,與一般人群比較,GH型垂體腺瘤患者患結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)更高且所患結(jié)直腸癌的惡性程度較高[15-16]。為探討GH型垂體腺瘤對結(jié)腸癌的影響,本研究對GH型垂體腺瘤GH3細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行ELISA檢測,結(jié)果提示GH3細(xì)胞分泌大量GH[(1 208±9)ng/mL],遠(yuǎn)超健康成人血清濃度(<2 ng/mL)。因此,與一般人群比較,高濃度的GH可能是促進(jìn)GH型垂體腺瘤患者結(jié)腸癌浸潤及轉(zhuǎn)移的重要原因。為驗(yàn)證這一假說,本研究對LoVo細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),并加入一定濃度的GH處理,探討GH對LoVo細(xì)胞的影響。為確定實(shí)驗(yàn)所用GH的最佳濃度及GH對LoVo細(xì)胞增殖的影響,本研究使用不同濃度的GH處理LoVo細(xì)胞,并通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性,結(jié)果提示GH可促進(jìn)LoVo細(xì)胞增殖,并在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。受GHR飽和效應(yīng)影響,當(dāng)GH濃度達(dá)到400 ng/mL后,GH的促增殖效應(yīng)不再增加。因此選擇200 ng/mL GH濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。此外,本研究發(fā)現(xiàn)GH可改變LoVo細(xì)胞周期,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞從G1期向S期和G2轉(zhuǎn)變,促進(jìn)有絲分裂。雖然GH是否影響腫瘤細(xì)胞增殖目前尚存爭議[17-18],但本研究表明GH可改變細(xì)胞周期促進(jìn)LoVo細(xì)胞增殖。為進(jìn)一步研究GH對LoVo細(xì)胞的影響,取對數(shù)生長期LoVo細(xì)胞在高濃度重組人GH處理下體外培養(yǎng),進(jìn)行Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn),結(jié)果證實(shí),高濃度GH可明顯促進(jìn)LoVo細(xì)胞侵襲和遷移。因此,對患有GH型垂體腺瘤的結(jié)腸癌患者,過量分泌的GH可能是促進(jìn)結(jié)直腸癌浸潤和轉(zhuǎn)移的原因。但GH促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和遷移的調(diào)控和分子機(jī)制尚未明確。

EMT是指細(xì)胞失去上皮表型并轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型的生物學(xué)過程,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān),在分子生物學(xué)水平上通常表現(xiàn)為上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)缺失和波形蛋白(Vimentin)表達(dá)增強(qiáng)[19-20]。其中E-cadherin的表達(dá)降低是EMT的關(guān)鍵步驟,它能改變細(xì)胞形態(tài),降低細(xì)胞間的黏附性,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移。Snail-1是一種富含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,可通過結(jié)合E-cadherin啟動子轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)附近的E2-box,抑制基因表達(dá)[21]。目前Snail-1已被證實(shí)在腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,并可通過降低E-cadherin的表達(dá)和誘導(dǎo)EMT促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移[22]。本研究結(jié)果顯示,高濃度GH可有效上調(diào)LoVo細(xì)胞N-cadherin、Vimentin和Snail-1的表達(dá)水平,抑制E-cadherin的表達(dá)水平,促進(jìn)EMT。以上研究結(jié)果表明,GH型垂體腺瘤可通過分泌大量GH上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞Snail-1的表達(dá),進(jìn)而下調(diào)E-cadherin的表達(dá),上調(diào)N-cadherin和Vimentin的表達(dá),影響細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞黏附,使細(xì)胞骨架重塑,促進(jìn)EMT。

綜上所述,本研究結(jié)果表明GH型垂體腺瘤細(xì)胞可分泌高濃度GH。高濃度GH可有效促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和遷移,其調(diào)控分子機(jī)制可能與高濃度GH促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT相關(guān)。同時(shí)研究證明GH可改變細(xì)胞周期促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。臨床上對患有GH型垂體腺瘤的患者,應(yīng)當(dāng)進(jìn)行結(jié)腸鏡篩查。對同時(shí)患有GH型垂體腺瘤和結(jié)腸癌的患者,應(yīng)當(dāng)關(guān)注結(jié)腸癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移。