細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑3在HPV16陽(yáng)性宮頸癌中的表達(dá)及意義

譙 坤,徐殿琴,朱小雨,周鑫竹,張 瑜,譚玉潔,△

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,貴陽(yáng) 550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院高血壓科,貴陽(yáng) 550004;3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心,貴陽(yáng) 550004)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅女性生命健康,其發(fā)病率高達(dá) 80/10萬(wàn),每年約50萬(wàn)新發(fā)病例且超過(guò)25萬(wàn)患者死亡,其中80%以上的新發(fā)病例位于發(fā)展中國(guó)家,是發(fā)展中國(guó)家女性死亡的重要病因[1]。該病即使在腫瘤初期開(kāi)始治療,很多患者的情況仍然持續(xù)惡化。但早發(fā)現(xiàn)、早治療仍是預(yù)防宮頸癌進(jìn)一步惡化的關(guān)鍵;此外,尋找新的治療策略也變得至關(guān)重要。研究指出,女性惡性腫瘤的形成和發(fā)展與細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑(cyclin dependent kinase inhibitor,CKI)的異常表達(dá)緊密相關(guān)[2-3]。CKI的表達(dá)由細(xì)胞內(nèi)多條途徑調(diào)控[4],通過(guò)研究這些途徑在不同腫瘤中的活躍程度及CKI的表達(dá)模式,可以深入了解這些腫瘤的形成機(jī)制,從而為治療女性惡性腫瘤提供關(guān)鍵信息[5]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑3(cyclin dependent kinase inhibitor 3,CDKN3)也稱細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1(cyclin dependent kinase inhibitor 1,CDI1)或核蛋白相關(guān)蛋白(kinetochore associated protein,KAP),是雙特異性蛋白磷酸酶家族的成員之一,作為一種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)控[6]。CDKN3在腫瘤診斷、治療耐藥及預(yù)后判斷方面均發(fā)揮作用[7-8],但其在人乳頭瘤病毒16(human papilloma virus 16,HPV16)陽(yáng)性宮頸癌中的表達(dá)及定位目前鮮有報(bào)道。因此,本研究旨在探討CDKN3在HPV16陽(yáng)性宮頸不同程度病變中的表達(dá)及意義,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2018年4-12月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科經(jīng)病理診斷確診的12例HPV16陽(yáng)性宮頸癌、12例HPV16陽(yáng)性宮頸癌前病變、10例HPV16陽(yáng)性慢性宮頸炎患者及7例HPV陰性正常宮頸者對(duì)應(yīng)組織石蠟切片,所有患者術(shù)前均未接受放化療及靶向治療。宮頸癌SiHa(HPV16陽(yáng)性)、HeLa(HPV18陽(yáng)性)、HCC94(HPV陰性)細(xì)胞株均購(gòu)自武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司。本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)[2019倫審第(166)號(hào)]。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)分析

1.2.1.1基因表達(dá)譜交互式分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)平臺(tái)分析CDKN3基因在宮頸癌及其他癌癥數(shù)據(jù)集中的表達(dá)

利用GEPIA網(wǎng)站(http：//gepia.cancer-pku.cn/)分析CDKN3在腺樣囊性癌、乳腺浸潤(rùn)性癌和宮頸鱗狀細(xì)胞癌等33種人類癌癥,以及306份宮頸癌組織樣品和13份正常宮頸組織樣品中的表達(dá)情況,在網(wǎng)站選中CDKN3進(jìn)行在線分析并以散點(diǎn)圖表示。

1.2.1.2基因表達(dá)綜合(Gene Expession Omnibu,GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDKN3在HPV16陽(yáng)性宮頸癌數(shù)據(jù)集中的表達(dá)

利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)分析CDKN3 mRNA在HPV16陽(yáng)性宮頸癌組織(43份)及正常宮頸組織(12份)中的表達(dá)。

1.2.2免疫組織化學(xué)檢測(cè)CDKN3在HPV16陽(yáng)性宮頸癌組織中的表達(dá)

取貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科HPV16陽(yáng)性宮頸癌(12份)、HPV16陽(yáng)性宮頸癌前病變(12份)、HPV16陽(yáng)性慢性宮頸炎(10份)及HPV陰性正常宮頸(7份)組織樣品,以10%甲醛溶液固定,隨后進(jìn)行石蠟包埋。將固定后的組織切割為薄片,置于玻片上烤干;經(jīng)過(guò)脫蠟和水化處理,檸檬酸鈉抗原修復(fù)液修復(fù)3 min;3%過(guò)氧化氫孵化30 min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶活性,隨后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min;山羊血清中孵化30 min以阻止非特異性結(jié)合,然后加入CDKN3抗體(1∶100),并在4 ℃濕盒中孵化過(guò)夜。第2天,切片室溫平衡30 min,移除一抗;PBS清洗3次,每次10 min,再加入酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物(武漢三鷹生物有限公司),室溫孵化2 h;移除二抗并再次用PBS清洗,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色3～5 min;蘇木素復(fù)染,鹽酸乙醇分化、返藍(lán)、脫水、透明化,最后進(jìn)行封片處理。根據(jù)組織切片著色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和染色范圍進(jìn)行評(píng)分。在5個(gè)高倍鏡視野下觀察并使用二級(jí)計(jì)分法,染色強(qiáng)度和范圍結(jié)合形成最終的免疫組織化學(xué)評(píng)分,其中0分為陰性,1～2分為弱陽(yáng)性,3～4分為中等陽(yáng)性,5分及以上為強(qiáng)陽(yáng)性。本研究將陰性和弱陽(yáng)性歸類為陰性,中等陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性歸類為陽(yáng)性。

1.2.3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1細(xì)胞培養(yǎng)

SiHa(HPV16陽(yáng)性)、HeLa(HPV18陽(yáng)性)細(xì)胞置于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng);HCC94(HPV陰性)細(xì)胞置于培養(yǎng)基RPMI-1640+10% FBS+1%青霉素(Penicillin,P)/鏈霉素(Streptomycin,S)中,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。均每2～3天更換培養(yǎng)基,細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí),使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.3.2Western blot檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞CDKN3的表達(dá)水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SiHa(HPV16陽(yáng)性)、HCC94(HPV陰性)和HeLa(HPV18陽(yáng)性)細(xì)胞,接種于6孔板,24 h后用RIPA液裂解并測(cè)定蛋白濃度。利用5%濃縮膠和10%分離膠進(jìn)行電泳,將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,含5%脫脂奶粉的TBST中封閉3～4 h,兔抗人CDKN3抗體(1∶1 000稀釋,美國(guó)Bioworld公司)孵育過(guò)夜;TBST清洗膜3次,在辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶10 000稀釋,美國(guó)Santa Cruz公司)中孵育2 h;TBST清洗3次,使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯影。以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參,用Image J1.53軟件分析CDKN3相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 CDKN3在泛癌中高表達(dá)

通過(guò)訪問(wèn)GEPIA平臺(tái),比較CDKN3在大部分腫瘤組織中的表達(dá)情況,并進(jìn)一步檢索比較正常宮頸組織(13份)和宮頸癌組織(306份)CDKN3的表達(dá),結(jié)果顯示：宮頸癌及其他腫瘤組織CDKN3表達(dá)水平明顯高于正常組織(P<0.05),見(jiàn)圖1、2。

Transcripts per million(TPM)：每百萬(wàn)個(gè)轉(zhuǎn)錄本中的數(shù)量;ACC：腎上腺皮質(zhì)癌;BLCA：膀胱尿道上皮癌;BRCA：乳腺浸潤(rùn)性癌;CESC：宮頸癌;CHOL：膽管癌;COAD：結(jié)腸腺癌;DLBC：淋巴樣腫瘤彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤;ESCA：食管癌;GBM：多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤;HNSC：頭頸部鱗狀細(xì)胞癌;KICH：腎褐色瘤;KIRC：腎透明細(xì)胞癌;KIRP：腎乳頭狀細(xì)胞癌;LAML：急性髓細(xì)胞樣白血病;LGG：腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤;LIHC：肝細(xì)胞癌;LUAD：肺腺癌;LUSC：肺鱗狀細(xì)胞癌;MESO：間皮瘤;OV：卵巢漿液性囊腺癌;PAAD：胰腺腺癌;PCPG：嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤;PRAD：前列腺腺癌;READ：直腸腺癌;SARC：肉瘤;SKCM：皮膚切除性黑色素瘤;STAD：胃腺癌;TGCT：睪丸生殖細(xì)胞瘤;THCA：甲狀腺癌;THYM：胸腺瘤;UCEC：子宮體部子宮內(nèi)膜癌;UCS：子宮肉瘤;UVM：葡萄膜黑色素瘤;T：腫瘤組織;N：正常組織。

TPM：每百萬(wàn)個(gè)轉(zhuǎn)錄本中的數(shù)量;CESC：宮頸癌;a：P<0.05。

2.2 CDKN3 mRNA在HPV16陽(yáng)性宮頸癌高表達(dá)

訪問(wèn)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)宮頸癌GSE39001數(shù)據(jù)集,分析正常宮頸組織(12份)和HPV16陽(yáng)性宮頸癌組織(43份)CDKN3 mRNA表達(dá)情況,結(jié)果顯示：HPV16陽(yáng)性宮頸癌組織CDKN3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯高于正常宮頸組織(P<0.001),見(jiàn)圖3、4。

a：P<0.001。

control：正常宮頸組織;HPV16-positive cervical cancer：HPV16陽(yáng)性宮頸癌組織。

2.3 不同宮頸病變組織CDKN3表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果顯示,HPV16陽(yáng)性宮頸癌(12份)、HPV16陽(yáng)性宮頸癌前病變(12份)、HPV16陽(yáng)性慢性宮頸炎(10份)及HPV陰性正常宮頸(7份)組織切片中CDKN3陽(yáng)性表達(dá)率分別為91.7%(11/12)、58.3%(7/12)、0(0/10)、0(0/7),均定位于細(xì)胞質(zhì),見(jiàn)圖5。

A：HPV陰性正常宮頸組織;B：HPV16陽(yáng)性慢性宮頸炎組織;C：HPV16陽(yáng)性宮頸癌前病變組織;D：HPV16陽(yáng)性宮頸癌組織。

2.4 不同宮頸癌細(xì)胞CDKN3表達(dá)情況

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,宮頸癌SiHa(HPV16陽(yáng)性)細(xì)胞CDKN3表達(dá)水平高于宮頸癌HeLa(HPV18陽(yáng)性)和HCC94(HPV陰性)細(xì)胞,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖6。

A：Western blot檢測(cè)不同宮頸癌細(xì)胞CDKN3表達(dá);B：不同宮頸癌細(xì)胞CDKN3表達(dá)水平比較柱狀圖;a：P<0.05。

3 討 論

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過(guò)程,對(duì)正常細(xì)胞增殖、分化和死亡至關(guān)重要[9]。在癌癥中,細(xì)胞周期調(diào)節(jié)功能紊亂是一個(gè)重要的特征,可導(dǎo)致細(xì)胞癌變[10]。CDKN3是一種雙特異性蛋白磷酸酶,與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)密切相關(guān)[11-12]。它與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent protein kinase,CDK)相互作用,調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)入S期,影響細(xì)胞增殖[13-15]。在不同類型的癌癥中,CDKN3的表達(dá)水平和作用不同,可能促進(jìn)或抑制癌癥的發(fā)展[16-18]。例如,在前列腺癌中,CDKN3高表達(dá)與較低的復(fù)發(fā)率相關(guān),敲除CDKN3可抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲[19]。然而,在其他癌癥中,如鼻咽癌和胃癌,CDKN3的高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)[20-21]。盡管CDKN3在許多癌癥中的作用已被研究,但其在HPV16陽(yáng)性宮頸癌中的作用仍有待深入探究。因此,本研究從生物信息學(xué)角度及相關(guān)實(shí)驗(yàn)中探討CDKN3在HPV16陽(yáng)性宮頸癌中的表達(dá)和意義。

本研究首先采用生物信息學(xué)分析,通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析候選基因(CDKN3)：(1)訪問(wèn)共享GEPIA平臺(tái),發(fā)現(xiàn)CDKN3在泛癌中普遍高表達(dá);也有文獻(xiàn)報(bào)道,在許多類型癌癥中觀察到CDKN3表達(dá)增加[22-23]。此外,宮頸癌及其他腫瘤組織CDKN3表達(dá)水平均高于正常組織,這與BARRN等[24]的研究結(jié)果一致。(2)訪問(wèn)GEO數(shù)據(jù)庫(kù),發(fā)現(xiàn)HPV16陽(yáng)性宮頸癌組織CDKN3 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常宮頸組織(P<0.001)。進(jìn)一步選取不同宮頸病變組織通過(guò)免疫組織化學(xué)法證實(shí),HPV16陽(yáng)性宮頸癌組織CDKN3陽(yáng)性表達(dá)率高于HPV陰性正常宮頸組織和HPV16陽(yáng)性慢性宮頸炎組織;此外,CDKN3在HPV16陽(yáng)性宮頸癌前病變中亦表達(dá),且均定位于細(xì)胞質(zhì),這與GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的結(jié)果相呼應(yīng)。最后,本研究通過(guò)Western blot檢測(cè)細(xì)胞中CDKN3表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)CDKN3在宮頸癌SiHa(HPV16陽(yáng)性)細(xì)胞中表達(dá)水平最高。這提示CDKN3可能與HPV16陽(yáng)性感染的宮頸癌有關(guān)。本課題后期將選取SiHa細(xì)胞深入探索CDKN3在HPV16陽(yáng)性宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制,為HPV16陽(yáng)性宮頸癌的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述,CDKN3可能是HPV16陽(yáng)性宮頸癌中一種潛在的致癌基因,可作為一種宮頸癌前病變及宮頸癌篩選標(biāo)志物,并為后續(xù)的機(jī)制研究及靶向治療提供理論基礎(chǔ)。