十種清熱解毒中藥提取物抗泛耐藥鮑曼不動桿菌感染的研究

楊 琰,馮建文,季 波,袁 進,王 妍,李 健,蔡學究,姜志輝

(1.南方醫科大學藥學院,廣東 廣州 510515; 2.中國人民解放軍南部戰區總醫院臨床藥學科,廣東 廣州 510010; 3.中國人民解放軍南部戰區總醫院藥劑科,廣東 廣州 510010; 4.中國人民解放軍南部戰區總醫院骨科,廣東 廣州 510010)

鮑曼不動桿菌是一類非發酵革蘭陰性桿菌,對環境的適應性強,在自然界和我國醫院中廣泛分布,已經成為醫院感染的主要病原菌之一。臨床抗菌藥物不合理使用導致鮑曼不動桿菌耐藥問題日趨嚴重[1-2],特別是泛耐藥鮑曼不動桿菌(extensively drug-resistantAcinetobacterbaumannii,XDR-AB),其耐藥機制復雜多樣,臨床治療異常困難,研發針對XDR-AB感染的新型抗菌藥物迫在眉睫[3]。清熱解毒中藥在感染性疾病的治療方面積累了豐富的經驗。《傷寒論》和《溫病條辨》中總結了許多行之有效的方劑,如瀉心湯、葛根芩連湯、白頭翁湯等。清熱解毒中藥成功治療溫病的臨床實踐為解決細菌耐藥問題提供了可行的創新路徑。秀麗隱桿線蟲是一種經典的試驗動物模型,體積小,結構簡單,全身透明易于觀察,具有可操控性強、遺傳背景清晰和生命周期短等特點,是藥物篩選的理想試驗模型[4]。相比體外抗菌活性,清熱解毒中藥在被感染的秀麗隱桿線蟲體內的抗菌活性更接近人體內的真實抗菌活性。本課題組前期建立了XDR-AB秀麗隱桿線蟲感染模型,具有良好的量效關系和穩定性,并對板藍根、金銀花、黃芩和連翹等75種《中國藥典》記載的經典清熱解毒中藥的體內抗XDR-AB活性進行了篩選,發現牡丹皮、冬凌草和何首烏的提取物具有較好的抗XDR-AB感染活性[5-6]。為進一步探討非經典清熱解毒中藥提取物的體內抗XDR-AB感染活性,并為發現新型抗XDR-AB感染先導化合物奠定前期研究基礎,本研究從《中藥大辭典》中選取了十種活性成分有體外抗菌作用的非經典清熱解毒中藥,在不同條件下制成提取物后,利用秀麗隱桿線蟲XDR-AB感染模型進行體內活性測定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥品和試劑 十味清熱解毒中藥金果欖、矮腳苦蒿、姜黃、白樺皮、敗醬草、藏報春、冷水花、山慈菇、駁骨草和土荊皮購自廣州康圣藥業有限公司,并經南部戰區總醫院中藥房執業中藥師劉艷艷鑒定。多黏菌素B(PMB,美國Sigma化學試劑公司),二甲基亞砜(DMSO,天津大茂化學試劑廠),瓊脂粉、胰蛋白胨、LB肉湯培養基、CAMHB肉湯培養基(青島高科工業園海博生物技術有限公司),腦心浸出液肉湯(BHI)培養基(廣東環凱微生物科技有限公司)。

1.1.2 儀器 WSI-3000型倒置生物顯微鏡(廣州微域光學儀器有限公司),SW-CJ-1F型凈化工作臺、DY04-13-44-00型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業有限公司),TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司),DHP-9012型恒溫培養箱、LRH-70型生化培養箱、HWS28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司),VITEK 2型微生物全自動鑒定藥敏儀(法國生物梅里埃公司),BP210S型電子分析天平(德國賽多利斯)。

1.1.3 菌株、秀麗隱桿線蟲 臨床分離的XDR-AB GZ-JZH-1由南部戰區總醫院檢驗科提供,藥敏試驗檢測結果見表1,其僅對多黏菌素和替加環素敏感,對其他常用抗菌藥物均耐藥;質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922,采用法國生物梅里埃公司VITEK 2微生物全自動鑒定藥敏儀進行鑒定及藥物敏感性試驗。秀麗隱桿線蟲由第二軍醫大學新藥研究中心藥學院惠贈。

表1 XDR-AB GZ-JZH-1藥敏檢測結果

1.2 方法

1.2.1 中藥材提取 分別稱取金果欖、矮腳苦蒿、姜黃、白樺皮、敗醬草、藏報春、冷水花、山慈菇、駁骨草和土荊皮6 g,并分成三等分置于3個250 mL圓底燒瓶中,按1∶12物料比分別加入蒸餾水、50%乙醇和95%乙醇30 mL。將3個不同溶劑的燒瓶分別于100、90、85℃加熱回流1.5 h后,對藥液進行減壓過濾。再次按1∶8 的物料比加入溶劑,重復提取1.5 h,合并濾液,60℃下減壓干燥獲得藥物浸膏,

置于-20℃保存備用。

1.2.2 秀麗隱桿線蟲感染模型的構建與驗證 使用含有10 μmol Fe3+的20% BHI培養基將同步化的秀麗隱桿線蟲(每塊板約1 000條)從線蟲標準培養基(nemathod growth media,NGM)平板上沖洗至15 mL離心管中,800 r/min離心1 min,棄上清液,加培養基至2 mL左右。挑取單個XDR-AB菌落于含有3 mL 20% BHI培養基的比濁管內,調整至0.5麥氏單位(約為1.5×108CFU/mL)。取300 μL菌液至2.7 mL 20% BHI培養基中進行10倍稀釋,使得菌液濃度約為1×107CFU/mL。吸取2 mL稀釋后的菌液加到秀麗隱桿線蟲管中,使XDR-AB以終濃度5×106CFU/mL感染秀麗隱桿線蟲,置于25℃、85%濕度下培養。

將秀麗隱桿線蟲與5×106CFU/mL的XDR-AB在20% BHI中共培養6 h后,顯微鏡下觀察秀麗隱桿線蟲的生存狀態,判斷是否存活。為進一步明確秀麗隱桿線蟲的死亡是XDR-AB所致,本試驗使用細胞膜紅色熒光探針Dil(1,1-雙十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚二碳菁)示蹤XDR-AB的感染路徑:稱取2 mg的Dil溶于1 mL的二甲基甲酰胺(DMF)中制備成Dil儲備液,將細菌懸浮在2 mL的M9溶液中,添加1 μL Dil儲備液,用錫紙避光,在25℃孵育3 h。使用M9溶液清洗細菌至少3次后,調整菌液終濃度為5×106CFU/mL,在25℃溫箱中感染秀麗隱桿線蟲6 h。最終感染后的秀麗隱桿線蟲用M9溶液清洗直至上清液完全無色為止,并使用熒光顯微鏡觀察細菌的熒光強度。

1.3 配制待測中藥系列濃度 稱取10 mg中藥浸膏于1.5 mL Ep管中,加入100 μL DMSO,再加入900 μL的20% BHI培養基將藥物溶解,20% BHI 10倍梯度稀釋4次,獲得濃度分別為10 000、1 000、100、10、1 μg/mL的藥液。陽性對照為20 μg/mL的PMB,陰性對照為DMSO。

1.4 篩選具有體內抗XDR-AB活性的中藥 秀麗隱桿線蟲感染6 h后,用20% BHI液體培養基清洗至少3次,將秀麗隱桿線蟲分配至96孔板中,15～20條/孔,每孔加培養基180 μL,藥液20 μL,使各提取物以1 000、100、10、1、0.1 μg/mL梯度終濃度進行干預,同時設置陽性對照孔(含2 μg/mL PMB和感染后的秀麗隱桿線蟲)和陰性對照孔(含1% DMSO和感染后的秀麗隱桿線蟲),于25℃、85%濕度培養36 h。計算秀麗隱桿線蟲存活率,判斷不同濃度的中藥提取物對感染秀麗隱桿線蟲的作用。每組設3組平行對照,求平均值。當陽性對照孔秀麗隱桿線蟲生存良好,陰性對照孔秀麗隱桿線蟲全部感染致死時計算試驗組存活率。秀麗隱桿線蟲存活率=試驗組秀麗隱桿線蟲存活數/試驗組秀麗隱桿線蟲總數×100%。

1.5 統計學分析 應用SPSS 25.0軟件進行分析。多組率的比較采用卡方檢驗和Fisher確切概率法。多重比較采用α分割法,檢驗水準α=0.05/比較次數(比較3次時,α=0.05/3=0.017)。

2 結果

2.1 秀麗隱桿線蟲顯微鏡觀察結果 感染模型構建完成后,顯微鏡下觀察秀麗隱桿線蟲形態,以判斷是否存活。存活秀麗隱桿線蟲呈現正弦狀態(見圖1A),咽部肌肉不停泵動,在光線和機械刺激時可以自由活動,而XDR-AB感染死亡的秀麗隱桿線蟲呈直線僵直不動狀態,秀麗隱桿線蟲的整個腸道充滿細菌(見圖1B),死亡秀麗隱桿線蟲和存活秀麗隱桿線蟲具有明顯的外觀差異。為進一步證實秀麗隱桿線蟲腸道的膨脹是由于XDR-AB的定植,用細胞膜紅色熒光探針Dil標記XDR-AB,示蹤其感染路徑。

注:A為存活狀態;B為XDR-AB感染后死亡狀態。

將秀麗隱桿線蟲置于含熒光標記細菌中共培養6 h后,可觀察到秀麗隱桿線蟲整個腸道明顯膨大,其中充滿大量的細菌,紅色熒光強度很高,見圖2。

圖2 細胞膜紅色熒光探針Dil標記的XDR-AB感染秀麗隱桿線蟲熒光顯微鏡下觀察結果(40×)

2.2 不同濃度的中藥提取液體內抗XDR-AB的活性 使用該秀麗隱桿線蟲感染模型從十種清熱解毒中藥中篩選對臨床XDR-AB GZ-JZH-1具有體內抗菌活性的中藥。結果顯示,姜黃和土荊皮表現出較好的體內抗XDR-AB活性。其中,姜黃的水提取物、50%乙醇提取物和95%乙醇提取物在濃度1 000 μg/mL時,可使XDR-AB感染的秀麗隱桿線

蟲存活率分別提高至54.2%(與陰性對照組比較,P<0.001)、18.8%、13.3%;土荊皮的水提取物、50%乙醇提取物和95%乙醇提取物在濃度1 000 μg/mL時,可使XDR-AB感染的秀麗隱桿線蟲存活率分別提高至47.4%(與陰性對照組比較,P<0.001)、23.8%(與陰性對照組比較,P=0.013)、15.8%。見表2。

表2 不同清熱解毒中藥提取物體內抗XDR-AB活性[秀麗隱桿線蟲存活率(%)]

2.3 不同中藥提取物體內抗XDR-AB的活性 姜黃與土荊皮的不同提取物抗XDR-AB感染活性不同。姜黃的水提物較50%乙醇提取物、95%乙醇提取物抗XDR-AB感染的活性更高(χ2值分別為10.04、17.16,P值分別為0.002、<0.001);50%乙醇提取物抗XDR-AB感染的活性與95%乙醇提取物比較,差異無統計學意義(P>0.017),且姜黃提取物的體內抗菌活性隨著乙醇濃度的提高而降低,水提取物的體內抗菌活性隨著濃度的增大而增強。土荊皮的水提取物較95%乙醇提取物抗XDR-AB感染的活性更高(χ2=8.77,P=0.003),水提取物、95%乙醇提取物抗XDR-AB感染的活性分別與50%乙醇提取物比較,差異均無統計學意義(均P>0.017)。見表2。姜黃與土荊皮水提取物的體內活性也具有較強的濃度依賴性。見圖3。

圖3 姜黃和土荊皮水提取物不同濃度下的秀麗隱桿線蟲存活率

3 討論

目前中藥的抗菌活性研究多集中在體外活性[7-9],體內抗菌活性研究仍較少,尤其是中藥抗XDR-AB的體內活性研究罕見報道。本課題組前期建立了XDR-AB感染的秀麗隱桿線蟲模型,能較真實地反映中藥提取物的體內抗XDR-AB的活性。本研究使用該模型對十種清熱解毒中藥進行測定,結果顯示姜黃和土荊皮的水提取物具有較好的體內抗XDR-AB活性,其余8種中藥基本沒有體內抗XDR-AB活性,表明清熱解毒中藥的體內抗菌藥效因中藥種屬、提取溶劑和細菌種類等因素而存在巨大的差異,姜黃和土荊皮發揮體內抗菌活性的成分可能以水溶性成分為主。

姜黃味辛溫,歸脾、肝經,有破血行氣、通經止痛之功效[10]。其主要活性成分姜黃素(含3%～6%)可通過破壞生物膜、下調基因表達、增加細胞膜的通透性和破壞細胞壁的完整性等機制發揮抗菌作用,可抑制金黃色葡萄球菌、鏈球菌、銅綠假單胞菌及幽門螺桿菌等病原體[11-12],但在體外對鮑曼不動桿菌無抑制活性(MIC>256 μg/mL)[13-14]。本研究首次發現姜黃具有體內抗XDR-AB感染的活性,且相同濃度下,水提取物的活性高于乙醇提取物。其原因可能是姜黃水提物中含有的單一成分或多種成分協同產生的體內藥效,也可能是姜黃素通過增強秀麗隱桿線蟲的免疫系統或是減弱XDR-AB的毒力發揮體內藥效。

土荊皮具有抗菌、抗腫瘤和抗血管生成等活性,土槿乙酸為土荊皮發揮抗微生物活性的主要成分,其對白念珠菌、石膏樣小孢子菌、球擬酵母菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均有明顯的抗菌作用,且對革蘭陰性菌的抗菌效果強于革蘭陽性菌[15-16]。但也有文獻[16]報道土槿乙酸對大腸埃希菌無體外抑制作用。鑒于其矛盾的抗菌藥效,很難判斷土荊皮起體內藥效的成分是土槿乙酸。因此,有必要對土槿乙酸以及其他土荊皮主要化學成分進行體內抗XDR-AB活性研究,以明確其體內藥效成分。綜上所述,本研究通過XDR-AB秀麗隱桿線蟲感染模型發現了姜黃和土荊皮具有較好的體內抗XDR-AB感染活性,但藥效物質尚需進一步研究確證。

本研究通過XDR-AB秀麗隱桿線蟲感染模型篩選出了具有體內抗XDR-AB活性的清熱解毒中藥姜黃和土荊皮,為其抗菌活性研究提供了研究基礎。接下來將進一步明確這兩種中藥提取物發揮體內抗XDR-AB活性的成分,并對其進行結構改造,為研發新型高效抗XDR-AB感染的抗菌藥物提供方向。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。