UPLC-MS/MS測定羊奶和羊奶粉中安乃近殘留量

李璐，楊家秀，王聰，董文君，張艷*

1.富平縣檢驗檢測中心 （陜西省羊乳產品質量監督檢驗中心）（富平 711700）；2.陜西圣唐乳業有限公司 （富平711700）

安乃近（metamizole sodium），是氨基比林和亞硫酸鈉的絡合物，屬于吡唑酮類的非甾體類解熱鎮痛抗炎藥，通過抑制前列腺素（PG）合成酶（環氧酶，COX-1、COX-2和COX-3），減少前列腺素合成而發揮藥效[1]。人因個體差異或不當使用會引起嚴重的不良反應，如皮疹、壞死性腸炎、再生障礙性貧血、肝腎功能異常、過敏性休克等[1]，美國、澳大利亞、日本等30多個國家已禁用或限用該藥。2020年我國停止安乃近注射液等品種的使用[2]，修訂安乃近片對妊娠晚期婦女和18歲以下青少年兒童禁用[3]。安乃近是獸醫臨床常用的治療藥物，對大型家畜的使用產生的不良反應通常不被人們重視。肌肉給藥24 h后，牛奶中殘留標志物4-甲基氨基安替比林濃度占總殘留的比例為27%[1]，羊奶中代謝殘留研究尚未見諸報道。國家要求食品動物的休藥期為28日，禁奶期為7日[4]，準確檢測安乃近的殘留量成為市場監管的必然要求。國家標準中規定安乃近在羊奶中的最大殘留限量為50 μg/kg[5]，與歐盟標準的規定相同[6]，羊奶粉根據出粉率折算成羊奶進行判定。

安乃近的檢測方法有分光光度法[7]、流動注射化學發光光度法[8]、薄層色譜法[9]、液相色譜法[10]、液相色譜-質譜聯用法等[11]，其中超高效液相色譜-質譜聯用（UPLC-MS/MS）技術有助于降低內源性物質的干擾[12]，適用于痕量藥物殘留的測定[13]。羊奶與牛奶的營養素構成和維生素、礦物質含量存在明顯差異[14]，所以亟須建立針對羊奶和羊奶粉中安乃近殘留量的檢測方法，對日常風險監測及地理標志產品的保護均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

4-氨基安替比林（4-aminoantipyrine，純度≥ 99.1%）、4-乙酰氨基安替比林（4-acetylaminbantipyrine，純度≥99.9%）、4-甲基氨基安替比林（4-methylaminoantipyrine，純度≥99.9%）：天津阿爾塔科技有限公司；4-甲酰氨基安替比林（4-formylaminoantipyrine，純度≥99.9%，壇墨質檢科技股份有限公司）；4-異丙基氨基安替比林-D6（4-isopropylantipyrine-D6，純度≥99.9%，北京曼哈格生物科技有限公司）；甲酸、乙酸銨、異丙醇（色譜純，阿拉丁試劑有限公司）；甲醇、乙酸、乙腈（色譜純，德國默克公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，分析純，天津市光復精細化工研究所）；羊奶和羊奶粉（陜西圣唐乳業有限公司）。

超高效液相色譜-質譜聯用儀1290-G6460C（配ESI離子源，美國安捷倫公司）；BEH C18色譜柱（柱長50 mm，柱內徑2.1 mm，填料粒徑1.8 μm，美國安捷倫公司）；MTN-5800A-24氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；H20-I-1-UV-T超純水機（德國賽多利斯集團）。

1.2 試驗方法

1.2.1 液相洗脫條件和質譜條件的選擇

分離條件以GB/T 22971—2008《牛奶和奶粉中安乃近代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》[15]為基礎，依據儀器條件和色譜柱的不同進行調整，使4個組分能充分被識別。

1.2.2 樣品制備方式的選擇

按照提取、濃縮的步驟制備試樣，以回收率和精密度考察方法的準確性?；厥章实挠嬎銋⒖糋B/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》[16]中附錄F的F.1，精密度參考F.3。

1.2.3 定量限的測定

在羊奶和羊奶粉中添加目標化合物，做平行樣，測基線噪音值，依據特征離子色譜峰rSN＞10為方法定量限[16]，測定方法的定量限。

2 結果與分析

2.1 液相洗脫條件和質譜條件優化

2.1.1 色譜條件

色譜柱C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為0.1%甲酸乙腈；梯度洗脫：0～4.0 min、90%～75% A，4.0～6.0 min、75%～70% A，6.0～10.0 min、70%～90% A；流速0.25 mL/min；進樣量2 μL。

2.1.2 質譜條件

電離方式ESI+；霧化器壓力35 Psi；毛細管電壓2 500 V；干燥氣溫度325 ℃；干燥氣流速12 L/min；多反應監測（MRM）模式?；衔锏钠渌麉狄姳?。

表1 各組分質譜分析參數

有機相采用甲醇時，由于第1個峰出峰早，所以出現肩峰現象，更換有機相為乙腈后峰形完好，調整使用乙腈作為有機相。當使用0.1%甲酸時，室溫下流動相的pH約2.5，并且同加入乙酸銨和乙酸時峰形和峰面積差異不顯著，所以不使用乙酸銨和乙酸作為流動相，也避免鹽類對質譜可能造成的損害。優化洗脫梯度后（見2.1.1），4個組分得到有效識別，濃度約100μg/L時的結果見圖1。

圖1 總離子流圖及定量多反應監測結果

2.2 提取條件的優化

為避免羊奶中含有大量的小分子蛋白質等物質的干擾，采用增大乙腈加入量進行提取，并且減少提取次數至1次，避免多次提取時小分子化合物使溶液渾濁，以減少基質效應產生的不良影響，也簡化了提取步驟，提高了提取效率。

2.3 樣品制備

稱取5.00 g羊奶，置于50 mL帶刻度的聚丙烯離心管中，加入50 μL 1.0 mg/L內標工作溶液、0.5 mL 1.0 mol/L的Tris溶液及20 mL乙腈，渦旋混合1 min，振蕩提取15 min，于4 ℃，5 000 r/min離心5 min，上清液轉移至25 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混勻，作為提取液。取5.0 mL提取液至10 mL玻璃刻度管中，加入5.0 mL異丙醇，混勻，于40 ℃氮吹至近干，加入1.0 mL初始流動相溶解，混勻后過0.22 μm濾膜，供超高效液相色譜-串聯質譜測定。

稱取12.5 g羊奶粉于100 mL燒杯中，加適量水（35～50 ℃）溶解，冷卻后加水至總質量100 g，混勻，按照上述羊奶的步驟處理。

2.4 內標量的優化

4-甲基氨基安替比林的測定采用4-異丙基氨基安替比林-D6作為同位素內標。選定內標化合物之后，關鍵在于確定合適的內標濃度[17]。內標濃度太大，前處理時損失的內標量也多，出于經濟節約考慮，在能夠滿足測定需求的前提下，內標的上機濃度選為最低濃度10 μg/L。

2.5 線性范圍、線性方程和定量限

吸取約0，50，250，500，1 000，2 000和5 000 μL 0.2 mg/L混合標準液及100 μL 1.0 mg/L內標工作溶液，用空白基質溶液定容至10 mL容量瓶中，得到基質混合標準系列溶液，現用現配。4-氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林和4-乙酰氨基安替比林采用外標法定量，4-甲基氨基安替比林以4-異丙基氨基安替比林-D6作為內標采用內標法定量。以峰面積（或與內標峰面積的比值）（y）為縱坐標，標準品質量濃度（x）為橫坐標，進行線性回歸擬合，各組分回歸方程結果如表2所示。相關系數R2＞0.995，線性關系良好，符合要求。

表2 4種組分的線性方程、相關系數

按照定量限的測定方法，離子色譜峰rSN＞10，測定定量限。4-氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林、4-乙酰氨基安替比林和4-甲基氨基安替比林的定量限分別為2.8，3.9，0.088和1.4 μg/kg。

2.6 重復性

在羊奶和羊奶粉樣品中分別添加約5和40 μg/kg的標準品進行重復性試驗，每個添加水平重復6次，計算變異系數（C.V.），結果見表3。變異系數為0.3%～ 2.0%，符合要求。

表3 羊奶和羊奶粉中安乃近的重復性（n=6）

2.7 回收率和精密度

在樣品基質中添加4個水平（羊奶約5，10，20和50 μg/kg；羊奶粉約40，80，160和400 μg/kg）的標準品進行加標回收試驗，計算回收率，每個添加水平重復6次，結果見表4。結果表明，4個組分的回收率為83.6%～100.2%，相對標準偏差（SRSD）為0.3%～ 6.5%，方法的回收率和精密度能夠滿足定量分析要求，結果準確可靠?；厥章拾词剑?）計算。

表4 羊奶和羊奶粉中安乃近的回收率和精密度（n=6）

回收率=（測得值-本底值）/添加量×100%（1）

2.8 樣品檢測結果

隨機抽取市場上3份樣品同質控樣品一并按照上述建立的超高效液相色譜-質譜聯用法進行檢測，結果見表5。抽取的羊奶樣品均沒超過國家標準中規定的安乃近的最大殘留限量50 μg/kg。一般情況下羊奶粉的出粉率約12.5%，安乃近的最大殘留限量折算成羊奶粉約400 μg/kg，抽取的羊奶粉樣品也沒超過該值。并且質控樣品測得值準確可靠，這3份樣品中安乃近殘留量遠不會對人體產生傷害作用。

3 結論

羊奶和羊奶粉復溶后加入Tris溶液，采用乙腈沉淀蛋白并提取安乃近殘留物，等量加入異丙醇促進氮吹濃縮的方式，建立一種超高效液相色譜-質譜聯用技術同時測定4-氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林、4-乙酰氨基安替比林和4-甲基氨基安替比林殘留量的方法。該方法前處理操作簡單，節約試劑耗材，用時短，既靈敏又準確，具有一定優越性，能夠很好地測定羊奶和羊奶粉中安乃近殘留量，可用于日常風險監測，提高市場監管水平。