青楷槭樹(shù)葉成分分析及其提取物的抗氧化能力研究

夏偉良，王美淇，張惠銘，邢楓，金鐵巖

延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院 （延吉133002）

青楷槭（AcertegmentosumMaxim.）又稱(chēng)為青楷子、遼東槭，是無(wú)患子科槭屬植物，其樹(shù)形高大挺拔，葉色翠綠繁茂，是一種極具園藝觀賞價(jià)值的樹(shù)種。它生長(zhǎng)在中國(guó)黑龍江、吉林、遼寧等省，在俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)和朝鮮北部也很常見(jiàn)[1]。青楷槭樹(shù)高10～15 m，樹(shù)皮灰色，表面光滑，枝干無(wú)毛。葉尖及上面深綠色，有光澤，葉面淺綠色，葉脈腋處有淡黃色毛，近圓形或橢圓形，長(zhǎng)10～12 cm，寬7.0～9.0 cm，鈍尖，有強(qiáng)烈的齒。莖光滑，長(zhǎng)4.0～7.0 cm，4月開(kāi)花，9月結(jié)果。花黃綠色，單性，無(wú)毛。花盤(pán)和子房光滑，雄蕊短，雄蕊略帶流蘇，稍彎曲。種子有光澤，棕黃色，堅(jiān)果稍扁平，翅鈍或幾乎水平展開(kāi)，果柄細(xì)長(zhǎng)，約5.0 mm[2]。研究表明，節(jié)疤樹(shù)根、枝和樹(shù)皮的提取物富含黃酮類(lèi)、紅景天苷和香豆素等多種化合物，具有抗氧化、抗菌、消炎和降血脂等作用，被廣泛用于治療出血性傷口和化膿性皮膚感染。最初對(duì)楓香的研究主要集中在該樹(shù)種的栽培和生態(tài)方面，杜欣勇等[1]將楓香作為研究對(duì)象，在不同的土壤條件下開(kāi)展研究，為楓香造林工作奠定了基礎(chǔ)；其次王興華[3]研究槭樹(shù)的生物學(xué)特性和生長(zhǎng)期的相關(guān)管理，為槭樹(shù)的開(kāi)發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。近年來(lái)，槭樹(shù)逐漸被發(fā)現(xiàn)，不僅可用于觀賞，其各種組織還具有重要的藥用和治療作用，如：鄔楠等[4]發(fā)現(xiàn)，從槭樹(shù)樹(shù)干樹(shù)皮中提取的提取物可有效預(yù)防脂多糖誘導(dǎo)的小鼠敗血癥，其機(jī)制被認(rèn)為與提取物的抗氧化能力以及減少TNF-α和IL-6的釋放有關(guān)；張?chǎng)蔚萚5]以青楷槭樹(shù)皮水提取物為起始原料，進(jìn)一步進(jìn)行抗氧化和抗菌活性的體外研究，結(jié)果表明青楷槭熱水提取物具有良好的自由基清除能力和抗菌能力；劉便強(qiáng)等[6]對(duì)青楷槭熱水提取物的抗氧化和抗菌活性開(kāi)展小試，結(jié)果表明青楷槭熱水提取物具有良好的自由基清除能力和抗菌能力。研究了青楷槭不同部位提取物的抗氧化活性，結(jié)果表明各層均具有良好的抗氧化活性，其中乙酸乙酯層的抗氧化活性最強(qiáng)。在韓國(guó)和日本的民間醫(yī)學(xué)中，青楷槭被認(rèn)為是治療疾病的良藥。國(guó)外研究表明，楓葉提取物含有大量活性物質(zhì)，具有廣泛治療特性，是功能食品和草本天然藥物的候選品種，具有良好的市場(chǎng)前景。關(guān)于青楷槭的抗氧化活性，Lee等[7]發(fā)現(xiàn)青楷槭皮提取物具有很好的清除自由基和三價(jià)鐵還原能力，而乙醇提取物的抗氧化活性更好；Eun等[8]在對(duì)青楷槭的抗糖尿病活性研究中證實(shí)青楷槭皮提取物的抗糖尿病作用。提取干燥的青楷槭莖，發(fā)現(xiàn)它能抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶，而抑制α-淀粉酶能提高抗氧化活性。Kwon等[9]在對(duì)青楷槭提取物的抗糖尿病活性進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，青楷槭皮提取物對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用；Cho等[10]在對(duì)青楷槭提取物的高血脂酸化活性進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，青楷槭莖和樹(shù)皮提取物能降低血脂水平，使脂肪細(xì)胞體積縮小60 μg/mL。綜上所述，青楷槭在藥物產(chǎn)品的生產(chǎn)方面越來(lái)越受到青睞，從青楷槭中提取的黃酮與多酚等物質(zhì)可清除自由基，具有很好的抗氧化能力，在降血脂、抑制糖尿病等方面的效果十分顯著。但現(xiàn)階段人們對(duì)其相關(guān)的深入生物活性研究并不充分，如：僅限于在其莖皮與樹(shù)皮方面的研究，其他組織的生物活性方面還有待挖掘；青楷槭生理活性的研究中有較多測(cè)定指標(biāo)，但對(duì)青楷槭樹(shù)葉的體外抗菌抗癌研究缺少相關(guān)機(jī)制的闡述；在抗癌活性的研究中有較多局限還在傳統(tǒng)認(rèn)知的肝癌上，存在單一性，對(duì)于其他癌細(xì)胞是否能抑制尚不清楚。因此對(duì)青楷槭樹(shù)葉 的生物活性研究進(jìn)行更深入研究將對(duì)青楷槭的資源利用及推動(dòng)青楷槭產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青楷槭樹(shù)葉：2022年5月于吉林省琿春市采集。

硫酸銅、硫酸鉀、乙腈、苯酚、亞甲基藍(lán)指示劑等，均為分析純，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；亞硝酸鈉（NaNO2）、硝酸鋁[Al(NO3)3]、氫氧化鈉（NaOH）、抗壞血酸（VC）、檸檬酸（CTA），均為分析純；DPPH標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）、ABTS標(biāo)準(zhǔn)品（超純），均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

分析天平（YP2002型，上海科教儀器有限公司）；紅外線(xiàn)水分測(cè)定儀（CSY-H5A型，深圳市分析儀器制造有限公司）；馬弗爐（KSW型，沈陽(yáng)市節(jié)能電爐廠(chǎng)）；索氏提取儀（SZF-06C型，浙江托普儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（DC-0506型，南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司）；全自動(dòng)凱氏定氮儀（KN680型，濟(jì)南阿爾瓦儀器有限公司）；原子吸收光譜儀（OES6000型，江蘇天瑞儀器股份有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101型，泰斯特儀器有限公司）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)[V-5800（PC）型，上海元析儀器有限公司]；電熱恒溫水浴鍋（DK-8D型，無(wú)錫沃信儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000B型，鞏義市瑞德儀器設(shè)備有限公司）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)分析儀（HBS-ScanY型，南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 青楷槭樹(shù)葉預(yù)處理

將試驗(yàn)用青楷槭樹(shù)葉清洗干凈，在通風(fēng)處晾曬之后由粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，放入-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 青楷槭樹(shù)葉一般成分測(cè)定

水分測(cè)定，取2.0 g左右青楷槭樹(shù)葉粉末置于紅外線(xiàn)水分測(cè)定儀托盤(pán)中，均勻鋪平，根據(jù)儀器提示規(guī)范操作，于105 ℃快速烘干，水量將以百分比直接顯示在儀表屏幕上。

粗灰分含量測(cè)定，參照GB 5009.4—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》；蛋白質(zhì)含量測(cè)定，參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；粗脂肪含量測(cè)定，參照GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》；碳水化合物含量測(cè)定，以青楷槭樹(shù)葉碳水化合物含量為100%中減去水分、粗灰分、蛋白質(zhì)和粗脂肪所測(cè)定的含量；總膳食纖維含量測(cè)定，參照GB 5009.88—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膳食纖維的測(cè)定》。

1.3.3 游離糖含量

參照GB 5009.8—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定》測(cè)定。

1.3.4 青楷槭樹(shù)葉提取物抗氧化能力

將青楷槭樹(shù)葉粉碎，過(guò)孔徑0.180 mm（80目）篩，取50 g青楷槭樹(shù)葉粉末按不同料液比、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行制備，制備好的樣品分別旋轉(zhuǎn)濃縮，而后凍干成粉末，最終得到青楷槭樹(shù)葉乙醇提取物（ATEE）和青楷槭樹(shù)葉熱水提取物（ATWE），于4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?duì)青楷槭樹(shù)葉提取物設(shè)計(jì)體外抗氧化試驗(yàn)測(cè)定青楷槭樹(shù)葉提取物的抗氧化性。

DPPH自由基清除能力：參考Williams等[11]的方法稍作修改，測(cè)定ATEE和ATWE對(duì)DPPH自由基的清除能力。將ATEE和ATWE與陽(yáng)性對(duì)照VC的溶液設(shè)置為0.01，0.05，0.10，0.50和1.00 mg/mL。稱(chēng)取30 μg的DPPH粉末，用無(wú)水乙醇定容至100 mL。將樣品溶液與 DPPH溶液按1∶1比例加入96孔板中，在避光條件按式（1）計(jì)算。

式中：A空白為100 μL DPPH溶液+100 μL蒸餾水的吸光度；A樣品為100 μL DPPH溶液+100 μL樣品溶液的吸光度。

ABTS+自由基清除能力：參考Garzon等[12]方法稍作修改，測(cè)定ATEE和ATWE對(duì)ABTS+自由基清除能力。

將7 mmol/L ABTS與 2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液等體積混合，遮光處理16 h，配得ABTS+儲(chǔ)備液。在測(cè)定ABTS+自由基清除能力前，將ABTS+儲(chǔ)備液在734 nm波長(zhǎng)處用蒸餾水稀釋至吸光度為0.70±0.02的工作液。使用蒸餾水將待測(cè)樣品溶液配制成質(zhì)量濃度分別為0.01，0.05，0.10，0.50和1.00 mg/mL的溶液作為待測(cè)液，備用。取0.1 mL樣品溶液與3.9 mL ABTS+儲(chǔ)備液充分混勻后靜置6 min，于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，記為Ai；使用相同方法，取3.9 mL ABTS+溶液與0.1 mL蒸餾水混合，測(cè)定吸光度A0，取3.9 mL蒸餾水與0.1 mL樣品溶液混合，測(cè)定吸光度為Aj。ABTS+清除率按式（2）計(jì)算。

式中：Ai為樣品吸光度；Aj為對(duì)照組吸光度；A0為空白組吸光度。

鐵離子還原能力：參照邵郅勝等[13]的測(cè)定方法稍加改動(dòng)，測(cè)定ATEE和ATWE對(duì)鐵離子的還原能力。分別移取5 mL質(zhì)量濃度為0.01，0.05，0.10，0.50和1.00 mg/mL的ATEE和ATWE稀釋液和陽(yáng)性對(duì)照檸檬酸于試管中，分別加入5 mL 0.1% K3[Fe(CN)6]溶液和5 mL pH 6.6的PBS緩沖液充分混勻，在50 ℃下恒溫水浴25 min后加入5 mL 10% TCA溶液充分反應(yīng)。取反應(yīng)后的溶液5 mL加入等量蒸餾水和1 mL 0.1% FeCl3溶液后放置10 min，于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定其吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，使用 Excel 2020統(tǒng)計(jì)與計(jì)算數(shù)據(jù)；利用SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 青楷槭樹(shù)葉一般成分的分析

試驗(yàn)測(cè)定青楷槭樹(shù)葉中的一般成分含量，結(jié)果如表1所示。青楷槭樹(shù)葉中水分、粗灰分、粗脂肪、蛋白質(zhì)以及碳水化合物含量分別為13.11%，4.68%，5.36%，19.57%和56.28% 。在青楷槭樹(shù)葉的碳水化合物中，膳食纖維在其中占比較高，含量為49.07%。膳食纖維在人體中發(fā)揮著重要的生理作用，它能改善腸道微生物結(jié)構(gòu)，降低血糖和血脂水平，有助于預(yù)防肥胖、糖尿病和其他慢性疾病。膳食纖維可以增加有益菌的數(shù)量，抑制有害菌的生長(zhǎng)，從而改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，通過(guò)調(diào)節(jié)胰腺的胰島素和葡萄糖分泌，改善代謝紊亂和胰島素拮抗作用，改變細(xì)胞氧化和抗氧化之間的平衡，減緩炎癥反應(yīng)，從而降低體內(nèi)血糖水平，維持血糖穩(wěn)定[14]。

表1 青楷槭樹(shù)葉一般成分含量

2.2 青楷槭樹(shù)葉游離糖含量的分析

試驗(yàn)測(cè)定青楷槭樹(shù)葉中游離糖的含量，結(jié)果如表2所示。青楷槭樹(shù)葉中的果糖含量最為豐富，其含量達(dá)5.08%，其次是葡萄糖，含量為3.42%，其中未檢測(cè)出麥芽糖和乳糖。果糖能使人精力充沛，減輕疲勞。適量果糖能提高血糖水平，減少低血糖癥，即低血糖引起的冷汗和黑眼圈[15]。

表2 青楷槭樹(shù)葉游離糖含量的分析

2.3 DPPH自由基清除能力

與抗氧化劑的有效成分結(jié)合后，抗氧化劑的顏色消失，與抗氧化劑反應(yīng)后，DPPH自由基被還原，導(dǎo)致吸收值下降，還原速度與它接受電子的數(shù)量，即自由基吸收能力有定量關(guān)系[16]。如圖1所示，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，ATEE和ATWE的DPPH自由基清除率均與樣品濃度關(guān)系呈正向相關(guān)，并在質(zhì)量濃度1 mg/mL時(shí)，清除率分別為86.25%和64.03%。在測(cè)試范圍內(nèi)，ATEE的DPPH自由基清除率均高于ATWE，綜上所述，ATEE與ATWE均有較好的DPPH自由基清除能力，且ATEE的DPPH自由基清除能力優(yōu)于ATWE。

圖1 ATEE和ATWE的DPPH自由基清除能力

2.4 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力

如圖2所示，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的上升，ATEE和ATWE對(duì)ABTS+自由基清除能力也逐漸增強(qiáng)，且在質(zhì)量濃度1 mg/mL時(shí)，ATEE清除率達(dá)93.31%，此時(shí)ATWE清除率為78.96%。總體而言，ATEE與ATWE均具有較好的ABTS+自由基清除能力，且ATEE在ABTS自由基清除能力上優(yōu)于ATWE。

2.5 鐵離子還原能力

鐵的還原能力是指在抗氧化劑存在下鐵的還原程度（從三價(jià)鐵到二價(jià)鐵的轉(zhuǎn)變）。分子一旦被還原就會(huì)改變顏色，在700 nm波長(zhǎng)處二價(jià)鐵含量與吸光度呈正相關(guān)關(guān)系，從而可通過(guò)分光光度法進(jìn)行測(cè)定[17]。如圖3所示，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著ATEE和ATWE質(zhì)量濃度的增大，兩者的鐵離子還原能力均升高，濃度較低（0～0.1 mg/mL）時(shí)，兩者所對(duì)應(yīng)的鐵離子還原力相差不大，隨質(zhì)量濃度升高（0.1～1 mg/mL），ATEE和ATWE鐵離子還原力均有較大提升，質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，ATEE的吸光度為2.76和ATWE的吸光度為1.84。綜上所述，ATEA與ATWE均具有極強(qiáng)的鐵離子還原能力，且ATEE的鐵還原能力優(yōu)于ATWE。

圖3 ATEE和ATWE的鐵離子還原能力

3 結(jié)論

試驗(yàn)測(cè)定青楷槭樹(shù)葉中的基本成分、游離糖含量及其提取物的抗氧化能力。

青楷槭樹(shù)葉中富含碳水化合物，其中很大一部分是纖維。研究和報(bào)告表明，膳食纖維可降低心血管疾病、冠心病、肥胖癥、糖尿病和其他疾病的風(fēng)險(xiǎn)[18]；青楷槭樹(shù)葉的膳食纖維含量較高，對(duì)改善相關(guān)領(lǐng)域可能具有良好的潛力，但可溶性與不可溶性成分的比例以及是否存在有效的活性功能還需進(jìn)一步分析和研究。

果糖、葡萄糖和半乳糖是人體內(nèi)的主要單糖，攝入相同量的果糖和葡萄糖時(shí)，攝入葡萄糖后血糖升高的速度遠(yuǎn)高于攝入果糖后血糖升高的速度，因此果糖及相關(guān)周邊產(chǎn)品被廣泛應(yīng)用于糖尿病患者的膳食參考標(biāo)準(zhǔn)中；試驗(yàn)表明，果糖可作為能量來(lái)源，促進(jìn)ATP合成，促進(jìn)紅細(xì)胞增殖，保護(hù)和維持正常的生理功能；青楷槭樹(shù)葉中果糖含量較高，這為青楷槭樹(shù)葉作為功能性食品原料提供理論依據(jù)。

結(jié)果表明：青楷槭樹(shù)葉水分為13.11%，粗灰分為4.68%，粗脂肪為5.36%，蛋白質(zhì)為19.57%，碳水化合物為56.28%，總膳食纖維為49.07%；青楷槭樹(shù)葉中檢測(cè)出3種游離糖，其中果糖、蔗糖、葡萄糖的含量分別為5.08%，1.37%和3.42%，未檢測(cè)出麥芽糖和乳糖。在青楷槭樹(shù)葉提取物的抗氧化試驗(yàn)中，將3種不同類(lèi)型的抗氧化測(cè)定作為檢測(cè)指標(biāo)，結(jié)果表明ATEE和ATWE均具有良好的抗氧化能力，且兩者質(zhì)量濃度均與其抗氧化能力呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，并在總體上ATEE抗氧化能力優(yōu)于ATWE。