金屬離子對枯草芽孢桿菌發酵產γ-聚谷氨酸的影響

馬雙雙，張英華，張杰，李珍愛，李艷艷，李海軍,2,3*

1.山東福瑞達生物科技有限公司 （臨沂 276715）；2.山東福瑞達醫藥集團有限公司 （濟南 250098）；3.山東省藥學科學院 （濟南250098）

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是一種由微生物合成、以谷氨酸為唯一單體的共聚高分子聚合物，其特點是溶液黏度高，具有高度的水溶性、保濕性、生物相容性、生物可降解性等優良特性，在醫藥、食品、化妝品、農業等領域具有廣泛應用[1-6]。但高黏度的特點同時也限制了發酵過程中傳質和傳氧，導致γ-PGA發酵產量低，限制γ-PGA的推廣應用[7-8]。針對上述問題，國內外開展大量研究工作，包括高產菌種篩選及改造、培養基及發酵工藝優化等，以期提高γ-PGA發酵產量，降低生產成本[9-14]。

金屬離子在微生物培養中發揮至關重要的作用，它們不僅可以促進微生物的生長及其代謝產物的合成，而且可以調節酶的活性，保護生物體的基本組織及細胞的完整性，調整細胞的滲透壓以及控制細胞的氧化還原電位等[15]，如：鈉可維持細胞膜內外滲透壓平衡；鉀參與細胞運輸系統的組成；鈣調節質膜的通透性；鎂能促進碳源的分解，加速菌體能量代謝；鋅、鐵、錳、銅等可作為酶的輔助因子，參與微生物代謝過程中的氧化還原反應，促進微生物生長[16-19]。因此，對培養基添加金屬離子對自行選育的枯草芽孢桿菌FRD215產γ-PGA的影響情況進行研究，以期通過在培養基添加金屬離子提高枯草芽孢桿菌發酵產γ-PGA的產量，為該菌株的工業化生產和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）FRD215，實驗室自行選育和保藏的菌種。

種子培養基：葡萄糖10 g/L，酵母粉5 g/L，谷氨酸鈉10 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，K2HPO42 g/L，pH 7.3～7.5，115 ℃，30 min。

發酵培養基：葡萄糖120 g/L（單獨滅菌）、蛋白胨10 g/L、谷氨酸鈉70 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L，K2HPO42 g/L、(NH4)2SO415 g/L，pH 7.3～7.5，121 ℃，20 min。

1.2 儀器與設備

電子分析天平、FE20 pH計[梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司]；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）；ZHJH-C1115B垂直流超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；ZHWY-211B恒溫培養振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；3-18臺式高速離心機（上海托莫斯科學儀器有限公司）；1200 Series高效液相色譜儀（Agilent Technologies）。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養方法

菌種培養：取菌種凍存管，菌種解凍后，取100 μL接種于裝有100 mL種子培養基的500 mL三角瓶中，在37 ℃，250 r/min條件下培養12～16 h。

發酵培養：將培養好的菌懸液按5%的轉種量，接種于裝有100 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中，在37 ℃，250 r/min條件下培養72 h。

1.3.2 試驗方法

1.3.2.1 單因素試驗

在原發酵培養基基礎上，分別添加不同濃度Na+、Ca2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+，其他發酵條件不變，具體添加量按照表1所示，每個試驗設置5個濃度梯度。

1.3.2.2 正交試驗

經過單因素試驗分析，采用正交試驗的方法優化金屬離子添加量，每組試驗均設置3個平行，以獲得更準確的結果。

1.3.3γ-PGA含量檢測方法

采用凝膠滲透色譜法（gel permeation chromatography，GPC）測定γ-PGA含量。

色譜條件：Waters Uittrahydrogel 100[7.8 mm× 3 0 0 mm（內徑）]色譜柱；流動相為10 mmol/L NaH2PO4·12H2O和15 mmol/L KH2PO4緩沖液，用0.22 μm的膜過濾器過濾；柱溫30 ℃；流動相流速0.5 mL/min；檢測波長210 nm；進樣量20 μL。

γ-PGA標準品曲線制作：取約0.1 g標準品，精確至0.000 1 g；溶于20 mL純化水中，攪拌1 h后，移至100 mL容量瓶中定容，配制成1 g/L母液，取適量母液逐級稀釋，配制0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 g/L的質量濃度梯度的標準液；經0.22 μm微孔濾膜過濾。利用紫外檢測器檢測，建立峰面積和標準品濃度的標準曲線。

樣品的配制：取約2.0 g樣品，精確至0.000 1 g；溶于20 mL蒸餾水中，攪拌1 h后，移至100 mL容量瓶中定容，按12 000 r/min處理5 min；上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾后進行檢測分析。

1.3.4 數據分析

采用Origin 8.3和SSPSAU軟件處理和分析試驗數據。

2 結果與分析

2.1 Na+對枯草芽孢桿菌發酵產γ-聚谷氨酸的影響

鈉與維持細胞滲透壓有關，是微生物發酵培養基的必要成分。試驗在原發酵培養基中添加NaCl，探究Na+對枯草芽孢桿菌發酵產γ-PGA的影響，結果如圖1所示。與對照組相比，添加量0.1～6.4 g/L對γ-PGA發酵產量無明顯影響，添加量25.6 g/L時，PGA發酵產量降低29.4%。培養基中適當的Na+水平可保證細胞膜的穩態，促進菌體的正常繁殖及代謝。如果Na+水平超出正常范圍，就可能引起細胞的質壁分離，導致菌體活性降低，進而影響目標產物的產量。試驗結果說明培養基中Na+含量已足夠維持枯草芽孢桿菌生產代謝需求。

2.2 Ca2+對枯草芽孢桿菌發酵產γ-聚谷氨酸的影響

鈣存在于細胞中，控制細胞的生理狀態，調節質膜的通透性，維持細胞體內的滲透壓，同時鈣離子還是許多酶的活性因子[16]。試驗在原發酵培養基中添加CaCl2，探究Ca2+對枯草芽孢桿菌發酵產γ-PGA的影響，結果如圖2所示。0.1～0.8 g/L的Ca2+對枯草芽孢桿菌發酵產γ-PGA有促進作用。與對照相比，隨著CaCl2添加量的增加，γ-PGA產量逐漸增加，且添加量0.8 g/L時，γ-PGA產量達到最高，比對照組提高25.2%。添加量1.6 g/L時，γ-PGA產量較對照組下降30.6%。這可能是由于過量的Ca2+與培養基中的磷酸鹽、硫酸鹽發生反應生成沉淀，導致培養基中營養元素缺失，進而導致γ-PGA產量下降。

2.3 Mn2+對枯草芽孢桿菌發酵產γ-聚谷氨酸的影響

錳可以顯著提升丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶等酶的活性，對芽孢桿菌芽孢的生成具有促進作用[15]。試驗在原發酵培養基中添加MnSO4·H2O，探究Mn2+對枯草芽孢桿菌發酵產γ-PGA的影響，結果如圖3所示。0.1～0.8 g/L的Mn2+對枯草芽孢桿菌發酵產γ-PGA有促進作用，但沒有明顯的濃度梯度效應。0.1 g/L和0.8 g/L的添加量γ-PGA的產量分別提高15.5%和16.4%。添加量1.6 g/L時，γ-PGA產量有所下降。這一結果與添加Ca2+的試驗結果類似，過量的Mn2+與培養基中的磷酸鹽發生反應生成沉淀，導致培養基中營養元素缺失，進而影響γ-PGA產量。

圖3 Mn2+對枯草芽孢桿菌發酵產γ-PGA的影響

2.4 Fe3+對枯草芽孢桿菌發酵產γ-聚谷氨酸的影響

鐵是菌體的細胞色素、細胞色素氧化酶和過氧化物酶的組成元素，是菌體生命活動必需的元素之一。試驗在原發酵培養基中添加FeCl3·7H2O，探究Fe3+對枯草芽孢桿菌發酵產γ-PGA的影響，結果如圖4所示。添加量0.02和0.04 g/L對枯草芽孢桿菌發酵產γ-PGA有促進作用，γ-PGA產量較對照組分別提高12.1%和9.8%。0.08 g/L及以上添加量對枯草芽孢桿菌發酵產γ-PGA有抑制作用，FeCl3·7H2O添加量0.32 g/L時，γ-PGA產量較對照組下降35.1%。

圖4 Fe3+對枯草芽孢桿菌發酵產γ-PGA的影響

2.5 Cu2+、Zn2+對枯草芽孢桿菌發酵產γ-聚谷氨酸的影響

鋅、銅可作為酶的輔助因子，參與微生物代謝過程中的氧化還原反應，促進微生物生長[21-22]。試驗在原發酵培養基中分別添加CuSO4·5H2O和ZnSO4，探究Cu2+和Zn2+對枯草芽孢桿菌發酵產γ-PGA的影響，結果如圖5和圖6所示。0.01～0.08 g/L濃度范圍內，Cu2+和Zn2+對枯草芽孢桿菌發酵產γ-PGA無明顯影響。添加量0.16 g/L時，其對枯草芽孢桿菌發酵產γ-PGA有抑制作用，γ-PGA產量分別降低17.8%和13.6%。

圖5 Cu2+對枯草芽孢桿菌發酵產γ-聚谷氨酸的影響

圖6 Zn2+對枯草芽孢桿菌發酵產γ-聚谷氨酸的影響

2.6 正交試驗確定金屬離子的最佳添加量

根據單因素試驗結果，對枯草芽孢桿菌發酵產γ-PGA有正影響的金屬離子分別是Ca2+、Mn2+、Fe3+。基于單因素試驗，將CaCl2添加量（A）、MnSO4·H2O添加量（B）和FeCl3·7H2O添加量（C）作為研究對象，并以γ-PGA產量作為指標，采用L9(33)的正交試驗表，詳細分析各個因素的影響。正交試驗因素水平如表2所示。結果與分析，如表3所示。

表2 正交試驗因素水平 單位：%

表3 正交試驗設計表及結果

從正交試驗結果可知：影響枯草芽孢桿菌產γ-PGA的因素順序為A＞C＞B，即CaCl2添加量＞FeCl3·7H2O添加量＞MnSO4·H2O添加量；最優組合為A2B2C2，即在原發酵培養基中同時添加CaCl20.8 g/L、FeCl3·7H2O 0.02 g/L、MnSO4·H2O 0.1 g/L。在此條件下，γ-PGA產量達53.34 g/L，比原發酵培養基至少提高40.0%以上。

3 結論

近來國內外主要選用芽孢桿菌屬為代表，研究微生物發酵法生產γ-PGA。培養基作為微生物發酵法中關鍵的一部分，對微生物的生長代謝影響巨大。而金屬離子作為培養基中的重要成分，參與細胞中多種生化反應，是微生物正常代謝必不可少的一類營養物質[19-21]。探究6種金屬離子對枯草芽孢桿菌FRD215發酵產γ-PGA的影響，單因素結果表明：不同種類、不同濃度的金屬離子對枯草芽孢桿菌產γ-PGA的影響差別較大。其中：在培養基中添加一定量的鈣、錳、鐵離子可促進枯草芽孢桿菌產γ-PGA，而添加鈉、銅、鋅離子對枯草芽孢桿菌產γ-PGA無明顯影響。通過正交試驗進一步確定培養基中鈣、錳、鐵離子的添加量，分別為CaCl20.8 g/L、FeCl3·7H2O 0.02 g/L、MnSO4·H2O 0.1 g/L，在此條件下，γ-PGA產量達53.34 g/L，比優化前至少提高40.0%以上。后續將繼續進行小試和大試放大試驗。

結果表明：發酵培養基中添加一定量的金屬離子鈣、錳、鐵可提高γ-PGA產量，該結果對枯草芽孢桿菌FRD215大規模應用和γ-PGA大規模生產具有指導意義。