微波輔助提取釀酒葡萄皮渣花色苷及抗氧化性研究

劉志偉，呂淑娟，趙琳，張媛雯，李慶亮，譚偉*

1.棗莊學(xué)院食品科學(xué)與制藥工程學(xué)院/山東省石榴精深加工工程技術(shù)研究中心 （棗莊 277160）；2.棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 （棗莊277160）

葡萄自絲綢之路傳入中原后便被廣泛應(yīng)用推廣，陜西、山東等地是葡萄的主要產(chǎn)區(qū)[1-2]。經(jīng)多年發(fā)展，我國在世界葡萄酒消費(fèi)市場占主要地位，葡萄酒行業(yè)在2020年全國營業(yè)收入達(dá)100.21億[3-4]。葡萄釀酒產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展使得葡萄釀酒副產(chǎn)物葡萄皮渣的產(chǎn)量不斷上升。葡萄皮渣內(nèi)富含白藜蘆醇、單寧、天然色素、黃酮、多酚等功能性物質(zhì)，但大部分的葡萄皮渣多被用作肥料或飼料，其利用率極低且會(huì)對環(huán)境造成一定的污染[5-7]。目前已有研究人員將葡萄皮渣內(nèi)活性成分添加到食品領(lǐng)域，以提高產(chǎn)品的感官與營養(yǎng)價(jià)值[8-11]。

花色苷屬于花色素類物質(zhì)，對葡萄酒顏色起關(guān)鍵作用，是一類天然存在于植物中的水溶性色素[12]，其綠色無毒，安全性高，具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、抗癌等藥理作用[13-15]。因此對釀酒葡萄皮渣綜合應(yīng)用的研究可提高葡萄皮渣利用率，延長食品產(chǎn)業(yè)鏈，降低對環(huán)境的不良影響。目前關(guān)于花色苷常用的提取方法有浸提法、酶解提取法、超高壓提取法等[16]。Liu等[17]通過變功率微波輔助提取法，在最優(yōu)條件下得到84.82%的藍(lán)莓花色苷萃取率。許丹妮等[18]采用雙水相法提取葡萄皮渣花色苷的最佳工藝需要在酸性條件下使用乙醇和硫酸銨液體，但試劑污染可能性較大。黃茜等[19]提取葡萄皮花色苷選用了內(nèi)部沸騰法，所得最佳工藝需在85 ℃下提取5 min，所用時(shí)間短，但過高的溫度不利于花色苷結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。郝俊光等[20]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在真空度0.08 MPa下提取120 min才能達(dá)到毛葡萄皮渣花色苷提取的最優(yōu)工藝，但試驗(yàn)時(shí)間過長，不適用于工廠加工和推廣。

經(jīng)文獻(xiàn)[17-20]比較，采用“西拉”葡萄皮渣為原料，檸檬酸為提取劑，利用微波進(jìn)行輔助處理，通過單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)，篩選出釀酒葡萄皮渣花色苷的最佳提取工藝；分析其對DPPH與ABTS+的清除能力，為葡萄釀酒葡萄皮廢渣的綜合利用提供科學(xué)依據(jù)，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“西拉”釀酒葡萄皮渣由山東君頂酒莊有限公司提供，烘干后，去籽留用；檸檬酸（國藥試劑有限公司）。

XH 200A型祥鵠電腦微波固液相合成/萃取儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）；PHS-2F數(shù)字pH計(jì)（上海澳司豪儀器有限公司）；UV-2600 紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；CPA224S萬分之一電子天平（德國塞多利斯公司）。

1.2 花色苷提取與含量計(jì)算

將干燥后的葡萄皮進(jìn)行粉碎，準(zhǔn)確稱取1.000 g葡萄皮粉末于試管中，按照不同的料液比加入檸檬酸溶液，在一定微波功率下提取一定時(shí)間后，得到花色苷提取液。

將1.0 mL提取液分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖液定容至10 mL，暗處理2 h后，用紫外分光光度計(jì)測定其在700 nm和520 nm波長處的吸光度，選用pH示差法測定計(jì)算總花色苷含量[21]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同檸檬酸濃度條件下花色苷提取

檸檬酸濃度分別設(shè)置為1.5%，2.0%，2.5%，3.0%和3.5%，設(shè)置微波功率450 W、微波時(shí)間20 min、溫度45 ℃、料液比1∶25（g/mL），根據(jù)提取的總花色苷含量選擇出最佳檸檬酸濃度。

1.3.2 不同料液比條件下花色苷提取

料液比分別設(shè)置為1∶15，1∶20，1∶25，1∶30和1∶35（g/mL），設(shè)置微波功率450 W、微波時(shí)間20 min、檸檬酸濃度2.5%，根據(jù)提取的總花色苷含量選擇出最佳料液比。

1.3.3 不同微波功率下花色苷提取

電氣設(shè)備的質(zhì)量問題首先體現(xiàn)在安裝方面，因?yàn)榘惭b過程中的動(dòng)、靜觸頭無法實(shí)現(xiàn)完全的接觸，或者是接觸面積達(dá)不到安全性的需要，也可能是因?yàn)閯?dòng)力不足，也容易存在很多的安裝操作失誤的情況，從而導(dǎo)致了接觸面積存在嚴(yán)重的電熱氧化問題，在具體的應(yīng)用過程中電阻增大，使得觸頭出現(xiàn)了強(qiáng)擊電流，造成了觸頭出現(xiàn)了損傷的情況，使用壽命也無法滿足使用的需要。其次，斷路器中的弧觸安裝中存在很多的問題，比如接觸力度不足等問題，使得在正常工作的過程中觸頭結(jié)構(gòu)的溫度持續(xù)的上升，使得溫度過高而存在絕緣介質(zhì)的分化，壓力會(huì)急劇的提升，一旦操作不當(dāng)就會(huì)出現(xiàn)因?yàn)闇囟瘸叨霈F(xiàn)爆炸的危害，極易造成工程安全性無法滿足要求[2]。

微波功率分別設(shè)置為350，450，550，650和750 W，設(shè)置料液比1∶25（g/mL）、微波時(shí)間20 min、檸檬酸濃度2.5%，根據(jù)提取的總花色苷含量選擇出最佳微波功率。

1.3.4 不同微波時(shí)間下花色苷提取

微波時(shí)間分別設(shè)置為10，20，30，40和50 min，設(shè)置微波功率450 W、料液比1∶25（g/mL）、檸檬酸濃度2.5%，根據(jù)提取的總花色苷含量選擇出最佳微波時(shí)間。

1.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平研究檸檬酸濃度、料液比、微波功率、微波時(shí)間四個(gè)因素對釀酒葡萄皮渣花色苷提取含量的影響，以此達(dá)到優(yōu)化其提取工藝的目的。

1.5 DPPH自由基清除的能力測定

參照張澤生等[22]的方法略作修改。將質(zhì)量濃度分別為0.4，0.8，1.2，1.6和2.0 mg/mL的葡萄皮渣花色苷提取液，分別與25 mg/L甲醇溶液混合均勻，黑暗反應(yīng)20 min后在515 nm波長處測定吸光度A1；用無水乙醇代替葡萄皮渣花色苷提取液，按照同樣的方法，測定吸光度A0，重復(fù)測定3次。DPPH自由基清除率=

1.6 ABTS+·清除能力的測定

根據(jù)王月等[23]的方法略作修改。將7.4 mmol/L ABTS+·溶液與2.6 mmol/L K2S2O8溶液混合，室溫暗處理12 h后用無水乙醇將混合液稀釋。將不同濃度的葡萄皮渣花色苷提取液與ABTS+工作液搖勻混合，室溫靜置6 min，在734 nm波長處測定吸光度A1。用無水乙醇代替葡萄皮渣提取液，同樣操作，測定吸光度A2，重復(fù)測定3次。ABTS+·清除率

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2013，每個(gè)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)測量數(shù)據(jù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。用SPSS 16.0數(shù)據(jù)分析軟件在P≤0.05水平下進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 檸檬酸濃度對釀酒葡萄皮花色苷提取影響

圖1 不同檸檬酸濃度對釀酒葡萄皮渣花色苷提取含量的影響

2.1.2 料液比對釀酒葡萄皮花色苷提取影響

如圖2所示，提取所得總花色苷含量隨料液比的減小呈先上升后降低趨勢。當(dāng)料液比達(dá)到1∶25（g/mL）時(shí)，提取的總花色苷含量達(dá)到最高，提取量為2.238 mg/g；料液比為1∶15（g/mL）提取的總花色苷含量最低。因此，選擇最佳料液比1∶25（g/mL）及兩邊的1∶20（g/mL），1∶30（g/mL）作為正交試驗(yàn)料液比的3個(gè)水平。

圖2 不同料液比對釀酒葡萄皮渣花色苷提取含量的影響

2.1.3 微波功率對釀酒葡萄皮花色苷提取影響

如圖3所示，總花色苷提取量隨微波功率的提高，總體上呈逐步上升趨勢。當(dāng)微波功率為750 W時(shí)，花色苷提取量達(dá)到最高，為3.313 mg/g。因此，考慮到功率與電量的關(guān)系，選擇750，650和550 W作為正交試驗(yàn)微波功率的3個(gè)水平。

注：不同小寫字母表示不同處理之間差異顯著（P＜0.05）。

2.1.4 微波時(shí)間對釀酒葡萄皮花色苷提取影響

如圖4所示，總花色苷含量隨微波時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢，含量在3.375～4.323 mg/g之間。微波時(shí)間40 min時(shí)，總花色苷含量最高，比30 min時(shí)高6.83%。因此，去掉總花色苷含量最低的兩個(gè)水平，選擇最佳微波時(shí)間40 min及30 min，20 min作為正交試驗(yàn)微波時(shí)間的3個(gè)水平。

注：不同小寫字母表示不同處理之間差異顯著（P＜0.05）。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

經(jīng)上述單因素試驗(yàn)分析，選擇各因素的三水平按照L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)表如表1所示。

表1 釀酒葡萄皮花色苷提取正交因素水平設(shè)計(jì)表

通過正交試驗(yàn)對釀酒葡萄皮查花色苷的提取條件的分析，結(jié)果表明，影響釀酒葡萄皮總花色苷含量提取的四個(gè)因素影響主次順序?yàn)榱弦罕龋緳幟仕釢舛龋疚⒉üβ剩疚⒉〞r(shí)間（見表2）。最佳提取工藝為料液比1∶30（g/mL）、2.50%的檸檬酸濃度、微波功率750 W、微波時(shí)間40 min。在此條件下做3次重復(fù)試驗(yàn)，所得總花色苷含量最高，為4.461 mg/g。

表2 花色苷提取正交試驗(yàn)分析表

2.3 釀酒葡萄皮花色苷對DPPH自由基和ABTS+·自由基的清除能力

從圖5可以看出，釀酒葡萄皮渣花色苷對DPPH自由基和ABTS+自由基均具有較強(qiáng)的清除能力，且隨質(zhì)量濃度的逐步提高，清除能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)釀酒葡萄皮渣花色苷的質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 mg/mL時(shí)，其對DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率分別可達(dá)76.20%和96.82%。

圖5 葡萄皮渣花色苷對DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力

3 討論及結(jié)論

葡萄皮渣作為葡萄副產(chǎn)品是一種可添加的生活功能性食品成分，其內(nèi)富含的花色苷具有著色功能，可視為人工合成添加劑的綠色替代品[24]。目前關(guān)于花色苷最常用的提取方法有溶劑浸提法、超聲輔助法、微波輔助提取法、加壓液體提取法等。黃瑜等[25]使用雙水相法提取葡萄皮渣中花色苷，在最優(yōu)條件（乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28.00%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.14%，pH 3.00，料液比為1∶35 g/mL）下花色苷得率為4.430 mg/g。張巖等[26]利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲提取葡萄皮渣花色苷的工藝，以2.50%的磷酸為提取劑，在料液比1∶25 g/mL，超聲功率300 W，50 ℃下超聲25 min，提取的花色苷含量為4.034 mg/g。文章主要研究微波輔助檸檬酸提取釀酒葡萄皮渣花色苷，通過單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)優(yōu)化了微波提取釀酒葡萄皮渣花色苷工藝的優(yōu)化。最優(yōu)條件：2.50%的檸檬酸為提取劑，在50 ℃下微波40 min，微波功率為750 W，選用1∶30（g/mL）的料液比，在此條件下，平行試驗(yàn)3次，提取的花色苷含量為4.461 mg/g，提取率可達(dá)4.461‰，高于前人研究。提取的花色苷對DPPH和ABTS+·自由基的清除能力較高，表明其具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

綜上：試驗(yàn)采用檸檬酸為提取液，在提高花色苷萃取率的同時(shí)降低試劑污染，不僅提取物的安全性得到提高，對自由基的清除能力也有所增強(qiáng)，為花色苷進(jìn)一步應(yīng)用于食品、保健、醫(yī)療等領(lǐng)域提供可行性的理論依據(jù)；試驗(yàn)過程中采用的溫度適中，利于花色苷的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；微波工藝用時(shí)短、效率高、工藝簡單，大大降低了試驗(yàn)時(shí)間與能耗，可在大規(guī)模生產(chǎn)的工廠中進(jìn)行推廣。