羅平小黃姜總黃酮提取工藝的優(yōu)化及抗氧化活性研究

劉靜，劉繼華，葉朋飛，李秋達(dá)，張春艷，黃慧福*

1.曲靖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 （曲靖 655011）；2.曲靖師范學(xué)院 （曲靖655011）

生姜是姜科多年生草本植物姜（ZingiberofficinaleRoscoe）的新鮮根莖，市面上所種植和銷售的生姜品種有面姜、大肉姜、竹根姜、張良姜、小黃姜等20余種。小黃姜在云南種植面積廣泛，主要分布在曲靖、文山、紅河等地，其中以羅平小黃姜品質(zhì)最佳，且為當(dāng)?shù)氐奶厣a(chǎn)業(yè)及致富產(chǎn)業(yè)，曾在2019年入選中國農(nóng)業(yè)品牌目錄。羅平縣地處滇東高原東南部，氣候溫潤，素有“姜之鄉(xiāng)”之稱，所產(chǎn)小黃姜質(zhì)細(xì)纖小，色澤鮮黃，姜味濃郁，截至2021年底，羅平小黃姜種植面積15 667 hm2，為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民收入的重要經(jīng)濟(jì)來源[1-2]。《中藥大辭典》中曾記載：小黃姜，性辛溫，味辛辣、微甘、微苦。生姜是生活中不可缺少的調(diào)味料，含有姜辣素[3]、黃酮類[4]、多酚類[5]等多種活性物質(zhì)，具有抗氧化[6-8]、消炎殺菌[9-10]、抑制腫瘤細(xì)胞增殖[11-13]、緩解糖尿病并發(fā)癥[14-15]等功能。黃酮類化合物為中藥中常見的物質(zhì)，且為生姜主要的抗氧化成分[16]。

試驗(yàn)選取液料比、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)為單因素，并對(duì)所得最優(yōu)單因素?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定羅平小黃姜中總黃酮的最佳提取工藝，并對(duì)小黃姜總黃酮提取液進(jìn)行體外抗氧化活性研究，為小黃姜的深度開發(fā)提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅平小黃姜（購于曲靖農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場）。蘆丁（純度≥98%，南京奧多福尼生物科技有限公司）；抗壞血酸（分析純，純度≥99.7%，西隴科學(xué)股份有限公司）；1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH·，純度HPLC＞97.0%）、2,2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS+·，純度＞98.0%），上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；無水碳酸鈉（分析純，天津市登峰化學(xué)試劑廠）；過硫酸鉀（分析純，濟(jì)南金昊化工有限公司）；亞硝酸鈉、硝酸鋁（均為分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；無水乙醇（分析純，天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

CP214電子分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；UV-5600PC紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；XMTD-204數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；XFB-500粉碎機(jī)（吉首市中誠制藥機(jī)械廠）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照吳存兵等[17]的方法并稍作改進(jìn)。配制質(zhì)量濃度0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，待用。吸取0，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液于25 mL具塞試管中，分別加入1.0 mL 5% NaNO3溶液，搖勻放置5 min，分別加入1.0 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻放置5 min，再分別加入10.0 mL 1.0 mol/L的NaOH溶液，用80%乙醇定容，搖勻后放置10 min，在510 nm波長處測定吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=2.668 7x-0.008 5（R2=0.999 6）。

1.3.2 總黃酮提取率的計(jì)算

黃酮類化合物在亞硝酸鹽作用下，與Al(NO3)3發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)生成黃色鋁絡(luò)合物，在堿性條件下顯紅色，510 nm波長下有最大吸收波長，因此可采用NaNO2-Al(NO3)3顯色法，以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以510 nm作為檢測波長測定吸光度，對(duì)比蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黃酮含量。

稱取10.000 0 g姜粉于500 mL燒杯中并加入一定濃度和體積的乙醇溶液，在一定溫度條件提取一定時(shí)間，減壓抽濾，濾液定容于100 mL容量瓶，得待測液，取1 mL待測液，按1.3.1的方法測定吸光度，同時(shí)做空白處理，小黃姜中總黃酮的提取率按式（1）計(jì)算。

式中：C為提取液黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；N為提取液稀釋倍數(shù)；M為提取黃酮的生姜粉末質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

選取不同梯度的液料比（15∶1，20∶1，25∶1，30∶1和35∶1 mL/g）、提取溫度（50，60，70，80和95 ℃）、提取時(shí)間（1，2，3，4和5 h）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%，50%，60%，70%和80%）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分析各單因素對(duì)羅平小黃姜總黃酮提取率的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以液料比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）為影響因素，進(jìn)行四因素三水平L9(34)的正交試驗(yàn)，對(duì)小黃姜中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素與水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平表

1.3.5 小黃姜總黃酮體外抗氧化試驗(yàn)

運(yùn)用最優(yōu)工藝條件對(duì)小黃姜中的總黃酮進(jìn)行提取，以此為母液，配制0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mg/mL的黃酮溶液為待測液，進(jìn)行體外抗氧化試驗(yàn)。

1.3.5.1 DPPH·自由基清除率的測定

DPPH·自由基清除率的測定方法參照董賀等[18]的方法，并加以改動(dòng)。取2.0 mL黃酮待測液和相同濃度的VC參照溶液于具塞試管中，配制0.1 mmol/L的DPPH·溶液，向上述試管中加入2.0 mL的DPPH·溶液，室溫下暗處靜置30 min后在波長517 nm處測定其吸光度。DPPH·清除率按式（2）計(jì)算。

式中：A1為加入樣品溶液的DPPH·吸光度；A2為未加DPPH·的樣品溶液吸光度；A0為加入無水乙醇的DPPH·吸光度。

1.3.5.2 ABTS+·自由基清除能力的測定

ABTS+·自由基清除能力的測定參照夏雨弘等[19]的方法并加以改動(dòng)。取ABTS+·自由基溶液（6.6 mmol/L）和K2S2O8溶液（3.2 mmol/L）等體積混勻，避光放置17～22 h，將ABTS+·自由基溶液用無水乙醇進(jìn)行稀釋，直至吸光度為0.70±0.02。

分別吸取0.2 mL不同濃度的黃酮溶液和相同濃度的VC參照溶液于具塞試管中，加入3.8 mL ABTS+·自由基溶液，混勻于暗處反應(yīng)5 min，在波長734 nm下測定吸光度。ABTS+·自由基清除率按式（3）計(jì)算。

式中：A4為加入樣品溶液的ABTS吸光度；A5為未加ABTS的樣品溶液吸光度；A3為加入無水乙醇的ABTS吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)小黃姜總黃酮提取率的影響

如圖1所示，液料比15∶1～25∶1（mL/g）時(shí)，小黃姜總黃酮提取率逐漸增大，并在25∶1（mL/g）時(shí)提取率達(dá)到最大4.847%。液料比25∶1～35∶1（mL/g）時(shí)，總黃酮的提取率隨之下降。分析原因可能是隨著溶劑體積的增加，小黃姜中的總黃酮已被基本提取出，且可能會(huì)浸出其他物質(zhì)，導(dǎo)致黃酮的提取率下降，且會(huì)造成溶劑的浪費(fèi)[20-21]。因此，最佳液料比為25∶1（mL/g）。

圖1 液料比對(duì)黃酮提取率的影響

2.1.2 提取溫度對(duì)小黃姜總黃酮提取率的影響

如圖2所示，提取溫度在50～80 ℃時(shí)，小黃姜中總黃酮的提取率逐漸上升，并在80 ℃時(shí)達(dá)到最大4.272%，隨著提取溫度繼續(xù)升高，提取率下降。隨著溫度的升高，分子的運(yùn)動(dòng)加快，黃酮類化合物能快速轉(zhuǎn)移到溶劑中，但溫度高于80 ℃時(shí)，黃酮提取率下降，分析可能由于溫度的升高，黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致提取率下降[22]。因此，最佳提取溫度為80 ℃。

圖2 提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)小黃姜總黃酮提取率的影響

如圖3所示，小黃姜中的提取率隨著提取時(shí)間的延長而先上升后下降，并在提取時(shí)間2 h時(shí)達(dá)到最大4.920%。提取時(shí)間2～5 h時(shí)，總黃酮的提取率逐漸下降，分析原因可能是隨著提取時(shí)間的延長，小黃姜粉末中的其他雜質(zhì)與黃酮類物質(zhì)存在提取競爭關(guān)系，小黃姜粉末中的其他物質(zhì)也被提取出來，導(dǎo)致總黃酮提取率的降低[23-24]。同時(shí)提取時(shí)間過長，提取成本增加。因此，最佳提取時(shí)間為2 h。

圖3 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)小黃姜總黃酮提取率的影響

如圖4所示，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%～70%時(shí)，小黃姜中總黃酮的提取率逐漸增大，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%時(shí)達(dá)到最大4.545%。乙醇體積分?jǐn)?shù)70%～80%時(shí)，總黃酮的提取率逐漸下降。分析原因可能是高體積分?jǐn)?shù)乙醇提取出非黃酮性成分，造成總黃酮提取率下降[25]。因此，最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

選取液料比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）為單因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果中極差值分析可知，各因素對(duì)小黃姜總黃酮提取率的影響順序?yàn)锳＞B＞C＞D，即為液料比＞提取溫度＞提取時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。小黃姜中總黃酮的最佳提取工藝條件為A2B2C3D1，即料液比25∶1（mL/g）、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間2.5 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%。同時(shí)，根據(jù)最佳提取條件組合進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果取平均值，為4.959%。試驗(yàn)結(jié)果表明在此條件下，提取率最高。

2.3 小黃姜總黃酮體外抗氧化試驗(yàn)

2.3.1 DPPH·自由基清除率的測定

對(duì)運(yùn)用最佳工藝條件提取到的小黃姜總黃酮溶液和VC溶液進(jìn)行DPPH·自由基清除試驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。質(zhì)量濃度0.2～1.0 mg/mL時(shí)，VC對(duì)DPPH自由基的清除能力增加迅速，隨后趨于平緩；小黃姜總黃酮提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力隨著總黃酮濃度的不斷增加而不斷增強(qiáng)，但仍低于VC的對(duì)DPPH自由基的清除能力。質(zhì)量濃度1.0 mg/mL時(shí)，小黃姜總黃酮對(duì)DPPH·清除力達(dá)到最大79.27%。

圖5 小黃姜總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除作用

2.3.2 ABTS+·清除率的測定

對(duì)運(yùn)用最佳工藝條件提取到的小黃姜總黃酮溶液和VC溶液進(jìn)行ABTS自由基清除試驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示。隨著質(zhì)量濃度增大，VC溶液對(duì)ABTS+·清除能力上升很快且強(qiáng)于小黃姜總黃酮提取液對(duì)ABTS+·清除力。質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL時(shí)，小黃姜總黃酮的質(zhì)量濃度與對(duì)ABTS+·清除力呈現(xiàn)正相關(guān)，質(zhì)量濃度1.0 mg/mL時(shí)，小黃姜總黃酮對(duì)ABTS+·清除力達(dá)到最大91.26%，與VC溶液的清除能力相當(dāng)。

圖6 小黃姜總黃酮對(duì)ABTS+·的清除作用

3 結(jié)論

小黃姜為曲靖市羅平縣的特色農(nóng)產(chǎn)品，辣味充足，風(fēng)味獨(dú)特，獲得海內(nèi)外消費(fèi)者的青睞。此次試驗(yàn)以羅平小黃姜為試驗(yàn)材料，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到小黃姜中總黃酮提取的最佳工藝條件：料液比25∶1（mL/g）、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間2.5 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%。在此條件下，小黃姜中總黃酮的提取率達(dá)4.959%。體外抗氧化試驗(yàn)表明，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，小黃姜總黃酮溶液的質(zhì)量濃度與DPPH·、ABTS+·自由基的清除能力呈正相關(guān)，且自由基的最大清除率分別為79.27%和91.26%，表明小黃姜總黃酮提取液具有一定的自由基清除能力，為后續(xù)小黃姜的開發(fā)利用提供一定依據(jù)。