離子液體輔助微波提取紫蘇梗中的黃酮

閆平，王詩媛，張彥，嚴(yán)惠仲，同紅娟，柴希艷

1.西安醫(yī)學(xué)院 （西安 710021）；2.西安風(fēng)吹麥浪農(nóng)產(chǎn)品技術(shù)開發(fā)有限公司 （西安 710065）；3.西安雨潤百德健康管理有限公司 （西安710065）

紫蘇[Perillafrutescens（L.）Britt.]是藥食同源的植物[1-2]。紫蘇葉近年來用以制作咸菜，紫蘇籽用來榨油，而紫蘇梗和花托、殘葉常作為農(nóng)產(chǎn)品廢棄物被焚燒或還田處理[1-2]。其實紫蘇籽、梗、葉等不同部位均可作為藥材使用[3-5]。紫蘇梗有理氣寬中、止痛、安胎的功效，用于治療胸膈痞悶、胃脘疼痛、噯氣嘔吐、胎動不安[6]。紫蘇籽、梗、葉中均含有黃酮、黃酮苷類化合物[3-5]，近年來紫蘇黃酮的提取研究多集中在紫蘇籽與紫蘇葉上，鮮有紫蘇梗中黃酮的提取與富集的研究[3-6]。

傳統(tǒng)提取黃酮的主要方法是有機(jī)溶劑提取，提取效率不高，資源利用度低，溶劑用量大，耗時[7]。離子液體（ionic liquid）是由有機(jī)陽離子和無機(jī)或有機(jī)陰離子組成的熔融鹽，有綠色環(huán)保、性質(zhì)穩(wěn)定、便于重復(fù)利用、萃取率高、可設(shè)計性強(qiáng)等特點(diǎn)，可減少萃取分離過程中的環(huán)境污染，同時可顯著提高提取率[7-8]。微波輔助提取技術(shù)在天然產(chǎn)物的提取中已得到廣泛應(yīng)用，具有提取率高、溶劑損耗少、時間較短、無醇不溶殘留等特點(diǎn)[9]。試驗運(yùn)用微波輔助離子液體提取紫蘇梗中黃酮類化合物。將兩者相結(jié)合，不但利用離子液體的獨(dú)特的性質(zhì)，而且彌補(bǔ)傳統(tǒng)提取法的不足，達(dá)到高效低耗、節(jié)約成本的效果。試驗用響應(yīng)曲面設(shè)計確定最佳提取條件。采用HPLC檢測提取的紫蘇梗中相應(yīng)主成分含量，分析不同方法提取出來的黃酮的主成分的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

紫蘇梗為唇形科植物紫蘇[Perillafrutescens（L.）Britt.]除去花葉花托的干燥莖，由楊凌子蘇生物科技有限公司提供，由鄭夢迪和汪興軍共同鑒定。

1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽（批號CP061097，蘭州奧力科精細(xì)化學(xué)品技術(shù)有限公司）；六氟磷酸鉀（批號P815654，純度99%，上海麥克林生化科技股份有限公司）；蘆丁（批號B20771，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；咖啡酸（批號HR15313S1，純度≥98%）、木犀草苷（批號HS09192B1，純度≥98%）、迷迭香酸（批號HR213S01，純度≥98%），均由寶雞晨光生物科技有限公司提供；甲醇（純度≥99.9%，Oceanpak）；甲酸（GC級≥98%，aladdin）；亞硝酸鈉（天津市巴斯夫化工有限公司）；硝酸鋁和氫氧化鈉（沈陽化學(xué)試劑廠）；所用水均為蒸餾水。

XH-300A型微波超聲波組合合成萃取儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）；1220型液相色譜儀（Agilent公司）；SQP型分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；755s型紫外分光光度計（上海棱光技術(shù)有限公司）；TDL-40B型醫(yī)用離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；RE52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；1510型全波長酶標(biāo)儀（昆山市超聲儀器有限公司）；等。

1.2 方法

1.2.1 紫蘇梗中黃酮的提取1.2.1.1 離子液體提取方法[10]

取2.0 g孔徑0.150 mm（100目）篩的紫蘇梗，加入1 mol/L的1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽離子液體與70%乙醇混合溶液至設(shè)定的料液比例，設(shè)定微波輸出功率，在規(guī)定的溫度下提取至設(shè)定時間后，得到粗提液。將5 g六氟磷酸鉀加50 mL蒸餾水完全溶解后室溫放置至沉淀不再增加時過濾即得飽和六氟磷酸鉀溶液[10]。取上粗提液與飽和六氟磷酸鉀溶液，按體積比1∶1混合后靜置4 h，待六氟磷酸鉀與離子液體形成復(fù)合鹽沉淀，在3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液[10]，即得去除離子液體的總黃酮樣品溶液。

1.2.1.2 傳統(tǒng)提取方法

取2.0 g孔徑0.150 mm（100目）篩的紫蘇梗，與70%乙醇混合形成料液比1∶20（g/mL）的混合溶液，在100 ℃下回流提取6 h后得到傳統(tǒng)方法下的樣品溶液[11-12]。

1.2.2 總黃酮的富集

參照文獻(xiàn)方法[13-14]將大孔樹脂D101預(yù)處理后，取1.2.1小節(jié)的離子液體提取方法中去除離子液體的總黃酮樣品溶液上清液，用70%乙醇稀釋后上樣到大孔樹脂D101的層析柱中，充分吸附，用水洗脫，洗至洗脫液無色并用濃硫酸檢測不出糖，用60%乙醇洗脫至FeCl3檢測呈陰性，分別收集水流出液和醇洗脫液，將醇洗脫液旋蒸至無醇味。

1.2.3 總黃酮含量測定

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，參照文獻(xiàn)方法[10,15]，采用AlCl3-NaNO2-NaOH顯色法于510 nm波長處測定吸光度，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。將1.2.2小節(jié)富集后得到的提取液用蒸餾水定容100 mL容量瓶中，作為供試品試液。重復(fù)以上操作，測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計算黃酮的濃度。

1.2.4 紫蘇梗總黃酮提取單因素考察

以紫蘇梗提取液中的總黃酮提取率為指標(biāo)，設(shè)定70%乙醇與離子液體體積比（簡稱離子液體體積比）分別為5∶1，10∶1，15∶1，20∶1和25∶1，微波功率分別為150，350，550，750和950 W，原料粉末與提取液比（簡稱料液比）分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL），溫度分別為40，50，60，70和80 ℃，進(jìn)行單因素試驗，確定適宜條件[10]。

1.2.5 紫蘇梗總黃酮提取響應(yīng)曲面設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取3個對紫蘇梗提取液中總黃酮提取率影響較大的因素，即料液比、離子液體體積比、微波功率。以3個因素為自變量（X），以黃酮提取率為響應(yīng)值（Y），使用Design-Expert 8.0.6軟件，依據(jù)Box-Behnken Design原理進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗設(shè)計，對提取條件進(jìn)行優(yōu)化[10,16]。試驗因素與水平見表1。

表1 紫蘇梗提取響應(yīng)面因素水平表

1.2.6 高效液相測定

1.2.6.1 色譜條件

參考文獻(xiàn)[5,17]，AgiLent5 HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。流動相為甲醇（B）-0.1%甲酸溶液（A）；波長335 nm。梯度洗脫條件：0～15 min，30%甲醇-0.1%甲酸水70%；15～35 min，51%甲醇-0.1%甲酸水49%；35～65 min，80%甲醇-0.1%甲酸水20%。

1.2.6.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取6.30 mg咖啡酸、2.01 mg木犀草苷、10.6 mg蘆丁、3.92 mg迷迭香酸，加甲醇定容至10 mL，制得不同質(zhì)量濃度的混合液，搖勻，即得，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

1.2.6.3 供試品溶液的制備

將制備0.016 mg/mL的紫蘇梗提取液搖勻，使用時過0.45 μm微孔濾膜備用，即得。

1.2.6.4 進(jìn)樣

取10 μL制備的紫蘇梗提取液，進(jìn)樣，測定咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、迷迭香酸的峰面積，測定其含量。

1.2.7 方法學(xué)考察

1.2.7.1 線性關(guān)系考察

精密吸取5，10，12和15 μL 1.2.6小節(jié)的混合對照品溶液，進(jìn)樣，按1.2.6小節(jié)的色譜條件進(jìn)樣分析，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，含量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計算[5,17]。

1.2.7.2 精密度試驗[5,17]

精密吸取混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計算咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、迷迭香酸的峰面積SRSD。

1.2.7.3 穩(wěn)定性試驗[5,17]

精密吸取10 μL同一批供試品溶液，于0，2，4，8，12，16，24和36 h進(jìn)樣，按1.2.6小節(jié)的色譜條件測定其峰面積，計算得到咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、迷迭香酸的SRSD。

1.2.7.4 重復(fù)性試驗[5,17]

取同一批次供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計算咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、迷迭香酸的峰面積SRSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取質(zhì)量濃度分別為0.008，0.016，0.024，0.032，0.040和0.048 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液各200 μL加入到96孔板，用酶標(biāo)儀測量510 nm波長下的吸光度。以蘆丁標(biāo)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=3 535.7X，R2=0.997 3。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 紫蘇梗總黃酮提取單因素考察

2.2.1 微波功率

取2.0 g紫蘇梗粉末，離子液體體積比30∶1，料液比1∶20（g/mL），提取溫度50 ℃，反應(yīng)時間8 min，微波功率分別為150，350，550，750和950 W，考察微波功率對黃酮提取率的影響。按照上述條件所得的提取液中黃酮提取率分別為0.59%，0.62%，0.71%，0.84%和0.75%。

由圖2可知，隨著微波功率的增加，紫蘇梗總黃酮提取率增加，微波功率750 W時黃酮提取率最高，750 W之后提取率反而變低，原因可能是微波功率過大使溫度上升太快，進(jìn)而使黃酮穩(wěn)定性降低。對紫蘇梗總黃酮提取的微波功率均選擇750 W。

圖2 微波功率對紫蘇梗黃酮提取率的影響

2.2.2 提取溫度

取2.0 g紫蘇梗粉末，70%乙醇與離子液體體積比20∶1，料液比1∶25（g/mL），微波功率750 W，反應(yīng)時間8 min，提取溫度分別為40，50，60，70和80 ℃，考察反應(yīng)溫度對黃酮提取率的影響。按照上述條件所得的黃酮提取率分別為1.19%，1.25%，1.34%，1.35%和1.29%。

由圖3可知，隨著溫度的增加，黃酮提取率增加，70 ℃時黃酮提取率最高，繼續(xù)升高溫度，黃酮提取率反而下降，原因可能是溫度太高使黃酮穩(wěn)定性降低。且由圖3可知，溫度升高對黃酮提取率的影響不大。此后提取溫度均選擇70 ℃。

圖3 提取溫度對紫蘇梗黃酮提取率的影響

2.2.3 料液比

取2.0 g紫蘇梗粉末，離子液體體積比20∶1，反應(yīng)溫度70 ℃，微波功率750 W，反應(yīng)時間8 min，料液比分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL），考察料液比對黃酮提取率的影響。按照上述條件所得的黃酮提取率分別為0.72%，1.07%，0.78%，0.52%和0.44%。

由圖4可知，料液比達(dá)到1∶20（g/mL）時，黃酮提取率最高。液料比繼續(xù)增大時，過多的提取劑會使微波能量傳遞減弱，使植物細(xì)胞破裂不完全，黃酮無法充分溶解，導(dǎo)致提取率下降。

圖4 料液比對紫蘇梗黃酮提取率的影響

2.2.4 離子液體體積比

取2.0 g紫蘇梗粉末，料液比1∶20（g/mL），微波功率750 W，提取溫度70 ℃，反應(yīng)時間8 min，70%乙醇與離子液體體積比分別為5∶1，10∶1，15∶1，20∶1和25∶1，考察離子液體體積比對黃酮提取率的影響。按此條件所得的黃酮提取率分別為1.01%，1.09%，0.95%，0.72%和0.69%。

由圖5可知，離子液體體積比10∶1時提取率最高，體積比接著增大時離子液體的相對濃度降低，萃取效率降低。

圖5 離子液體體積比對紫蘇梗黃酮提取率的影響

2.3 紫蘇梗總黃酮提取響應(yīng)曲面設(shè)計

按照單因素試驗結(jié)果，以黃酮提取率為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平試驗，根據(jù)軟件設(shè)計17組試驗方案并完成測定，結(jié)果見表2。微波功率（A）、料液比（B）、離子液體體積比（C）與提取率（Y）之間的線性回歸方程為Y=-0.068 280+0.002 131A+1.588 670B+0.011 854C+0.000 286AB+0.000 007AC-0.022 857BC-0.000 002A2-11.561 220B2-0.000 854C2。

表2 紫蘇梗響應(yīng)曲面試驗方案及結(jié)果

由圖6～圖8可知，響應(yīng)曲面預(yù)測的最佳工藝條件為微波功率750 W、料液比1∶28.35（g/mL）、離子液體體積比11.77∶1、溫度70 ℃，在該最佳工藝條件下提取紫蘇梗黃酮的提取率預(yù)測值為0.187 206%。

圖6 微波功率、料液比的響應(yīng)曲面與等高曲線圖

圖7 微波功率、離子液體體積比的響應(yīng)曲面與等高線圖

圖8 料液比、離子液體體積比的響應(yīng)曲面與等高線圖

對該模型方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗，結(jié)果顯示，回歸方程模型F值為45.05，P值小于0.000 1，表明模型顯著，響應(yīng)面試驗的回歸方程預(yù)測紫蘇梗中的黃酮提取率可行。由P值可知，在此試驗范圍內(nèi)的3個因素對提取率的影響大小順序為微波功率（A）＞離子液體體積比（C）＞料液比（B），因素A、C、A2、B2、C2對提取效果的線性效應(yīng)均顯著，見表3。

表3 黃酮提取率模型的顯著性檢驗及方差分析

按照響應(yīng)面預(yù)測最佳工藝條件，采取微波功率750 W、料液比1∶30（g/mL）、離子液體體積比12∶1、溫度70 ℃條件進(jìn)行3次平行試驗，3次平行試驗提取率分別為0.188%，0.176%和0.184%，平均提取率0.183%，與預(yù)測值0.187 206%基本吻合，說明響應(yīng)面設(shè)計方案合理。

2.4 HPLC法測定主成分含量

2.4.1 方法學(xué)考察結(jié)果

2.4.1.1 線性關(guān)系

各標(biāo)準(zhǔn)品的回歸曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍見表4。

表4 各標(biāo)準(zhǔn)品的回歸曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍

2.4.1.2 精密度試驗

咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、迷迭香酸的峰面積SRSD分別為3.27%，3.04%，3.36%和4.52%，表明儀器精密度良好。

2.4.1.3 穩(wěn)定性試驗

咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、迷迭香酸的SRSD為0.23%，0.19%，0.41%和0.18%，表明供試品溶液在36 h之內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.1.4 重復(fù)性試驗

咖啡酸、木犀草苷、蘆丁、迷迭香酸的峰面積SRSD分別為0.26%，0.19%，0.49%和0.19%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.4.2 含量測定

取制備的紫蘇梗樣品，按照1.2.6小節(jié)的色譜條件進(jìn)樣測定的峰面積，運(yùn)用外標(biāo)一點(diǎn)法測定其含量，計算得到含量測定結(jié)果，見表5。主成分高效液相色譜圖見圖9。

圖9 主成分高效液相色譜圖

表5 紫蘇梗部分主成分含量測定 單位：mg/g

由表5可知，離子液體輔助微波提取的黃酮中木犀草苷和蘆丁比傳統(tǒng)方法含量均高，說明該方法切實可行。此外，《藥典》中規(guī)定的紫蘇梗的指標(biāo)性成分迷迭香酸的含量也高于傳統(tǒng)方法[18]。

3 結(jié)論與討論

使用響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化提取工藝，該模型應(yīng)用隨機(jī)過程的統(tǒng)計學(xué)試驗方法，同時采用微波提取作為提取手段，有提取溶劑用量少、時間較短、節(jié)能環(huán)保等特點(diǎn)[19]，離子液體為輔助提取溶劑，具有提取率高、溶劑損耗少的特點(diǎn)[20]。新方法即離子液體輔助微波提取比傳統(tǒng)方法總黃酮主成分提取率高。最佳工藝為微波功率750 W，料液比1∶30（g/mL），離子液體體積比12∶1，溫度70 ℃，在該最佳工藝下提取紫蘇梗黃酮的提取率預(yù)測值為0.187 206%。經(jīng)試驗驗證黃酮平均提取率為0.183%，與預(yù)測值接近，說明響應(yīng)面設(shè)計方案合理。按照新方法提取得到的紫蘇提取物中紫蘇中具有抗氧化、抗腫瘤等活性的黃酮成分木犀草苷和蘆丁含量均高于傳統(tǒng)方法，且酚酸類主成分迷迭香酸和咖啡酸也高于傳統(tǒng)方法[21-22]。因此，試驗所優(yōu)化的最佳提取方案可行，將微波輔助離子液體運(yùn)用于紫蘇梗黃酮提取的方法可行。

提取黃酮類化合物采用的離子液體主要是烷基咪唑鹽類，其中以1-丁基-3-甲基咪唑鹽類居多。蘇適等[24-25]以1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽離子液體為提取劑，采用超聲波輔助提取黑豆異黃酮；微波輔助離子液體提取黑豆皮花青素，且提取率均大于傳統(tǒng)方法。潘思源等[26]進(jìn)行了微波輔助離子液體提取法與傳統(tǒng)提取方法對羅布麻葉總黃酮的提取研究，結(jié)果表明微波離子液體法比微波乙醇法和乙醇熱回流法所得的總黃酮提取量均高。

試驗具有一定創(chuàng)新性。離子液體作為一種綠色環(huán)保溶劑，減少能耗，有助于植物黃酮的提取[19]。試驗使用的咪唑類離子液體可作為提取劑用于植物中多種活性物質(zhì)如生物堿類、黃酮類、果膠、色素、植物內(nèi)酯等的提取[20]。試驗具有一定的應(yīng)用價值。紫蘇梗作為農(nóng)產(chǎn)品廢棄物被丟棄或焚燒，紫蘇梗富含木質(zhì)纖維素和高附加值天然活性物質(zhì)，現(xiàn)處置方式多為焚燒或直接還田，造成紫蘇梗中天然活性物質(zhì)喪失[23]，既污染環(huán)境又造成浪費(fèi)。試驗實現(xiàn)從紫蘇梗中提取與富集黃酮，為高效環(huán)保開發(fā)利用這種生物活性成分提供切實可行的解決方案，填補(bǔ)國內(nèi)空白，可實現(xiàn)農(nóng)副產(chǎn)品的綜合利用。采用新型綠色的有機(jī)溶劑離子液體提取，為農(nóng)產(chǎn)品廢棄物中活性成分的提取與后期的綜合利用與開發(fā)提供新思路。

試驗仍存在不足，未完全闡明離子液體提取黃酮的具體原理。猜測可能與化合物的極性和離子液體的結(jié)合方式有關(guān)，也可能與化合物中酚羥基含量有關(guān)，還可與離子液體黏度及傳質(zhì)效果有關(guān)，溴離子與被提取物之間可能產(chǎn)生多重相互作用[10]。紫蘇梗中富含纖維素[23]，后期可加上生物酶解的步驟，先分解其中的纖維素，可能更能提高紫蘇黃酮的提取率。另外，紫蘇中黃酮苷類主要以野黃芩素、木犀草素、芹菜素為母核的單糖及二糖葡萄糖醛酸苷類成分為主[21-22]，該類成分的高效提取有待后續(xù)深入研究。