響應面法優化酶-超聲提取黑枸杞花青素及抗氧化性研究

張冬梅，王麗杰，潘悅

錦州醫科大學食品與健康學院 （錦州121001）

黑枸杞是我國西部沙漠地帶特有的一種植物黑枸杞，主要產自我國的青海省、甘肅省以及西藏等地區，也是目前已知的花青素最多的野生植物[1]?；ㄇ嗨?，又稱花色素，是一種可溶于水的天然色素，在植物體內廣泛分布。研究表明，較高的花青素攝入量與較低的癌癥風險有關[2]?；谄鋵】档囊嫣?，花青素作為膳食抗氧化劑和營養保健品具有潛在的益處[3]。

花青素會受到光、熱、酸和堿的負面影響。因此，為了在不降解的情況下獲得最大量的花青素和其他生物活性分子，選擇一種對花青素損傷最小的提取方法至關重要[4]，而且，雖然黑枸杞中花青素的含量很高，但是產量較低，這給它的使用和試驗帶來了一些不便。從植物中提取花青素的方法有溶劑萃取、酶萃取、超臨界二氧化碳萃取、超聲波、微波等[5]。酶促法是一種高效、條件溫和、環境友好的提取方法，其利用酶反應的高度專一性將植物細胞壁降解，從而可以獲取其內容物。Laophongphit等[6]的研究表明果膠酶和熱處理顯著提高了Mahachanok芒果果肉的酚類含量，而且對類胡蘿卜素含量和抗氧化能力沒有影響。超聲輔助提取法是目前常用提取方法之一，該法利用高頻率超聲波在振蕩過程中產生空化作用使植物細胞壁受損，從而加速有效成分溶出[7]。陳俊樸等[8]采用超聲輔助提取紫大薯原花青素，最佳工藝為超聲時間19 min、液料比1∶22（g/mL）、鹽酸體積分數0.63%，花青素的提取量為93.62 mg/100 g，提取量顯著高于未超聲前。

提取是從植物原料中回收有效成分的關鍵步驟[9]。需要一種有效的提取方法，以獲得高濃度目標化合物的最大收率。文章采用響應面方法優化了酶-超聲波提取黑枸杞花青素的最佳工藝條件，為進一步開發利用黑枸杞奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑枸杞（市售，產地青海）；果膠酶（酶活性≥ 30 000 U/g，滄州夏盛酶生物技術有限公司）；乙醇（國藥化學試劑有限公司）；鹽酸（青島福通化工有限公司）；氯化鉀、乙酸鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、抗壞血酸（興恒泰化工科技有限公司）；冰乙酸（上海艾瑞化工有限公司）；過硫酸鉀（百運度生物科技有限公司）；2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：北京盒子生工科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DH-945型電熱恒溫鼓風干燥箱（蘇州格瑞達有限公司）；ZN粉碎機（螞蟻源科技有限公司）；85-A型恒溫磁力攪拌器（上海梅穎浦有限公司）；DK-1型電熱恒溫水浴鍋（天津奧特塞恩儀器有限公司）；TL-5A型臺式電動離心機（廣州吉迪儀器有限公司）；GT-P9型超聲波清洗機（徐州永泰有限公司）；PHS-25臺式酸度計（上海霍亨有限公司）；UV-B型紫外分光光度計（上海奧析有限公司）；LCFA104型分析天平（上海天平儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

黑枸杞去蒂→45 ℃干燥至恒重，磨碎→過0.250 mm篩網，置于-4 ℃，避光處貯存，待用

1.3.2 黑枸杞花青素提取

準確稱取0.5 g黑枸杞粉，加入經過酸化的70%乙醇溶液（pH 1）及一定量的果膠酶[10]。將混合物于40 ℃使用恒溫磁力攪拌器攪拌10 min[11]。在一定超聲功率下提取一段時間后于離心機中按10 000 r/min離心35 min，收集上清液。將提取液取0.25 mL，用緩沖液定容到25 mL，用pH差示法測定黑枸杞花青素的含量。

1.3.3 花青素含量的計算

花青素含量（mg/g）按式（1）計算。

式中：A=（A527-A700）pH1.0-（A527-A700）pH4.5；Mr為分子質量（以C3G摩爾質量計算），449.2 g/mol；Df為稀釋倍數；ε為C3G摩爾質量的消光系數，26 900 L/（mol·cm）；I為光程，1.0 cm；m為樣品質量，mg。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 液料比值對花青素含量的影響

固定超聲功率150 W、超聲時間15 min、酶用量0.4%，液料比值分別為2.5，5，7.5，10和12.5 mL/g，考察液料比值對花青素含量的影響。每個水平均做3個平行。

1.3.4.2 超聲功率對花青素含量的影響

固定液料比值5 mL/g、超聲時間15 min、酶用量0.4%，超聲功率分別為100，150，200，250和300 W，考察超聲功率對花青素含量的影響。每個水平均做3個平行。

1.3.4.3 超聲時間對花青素含量的影響

固定液料比值5 mL/g、超聲功率150 W、酶用量0.4%，超聲時間分別為10，15，20，25和30 min，考察超聲時間對花青素含量的影響。每個水平均做3個平行。

1.3.4.4 酶用量對花青素含量的影響

固定液料比值5 mL/g、超聲功率150 W、超聲時間15 min，酶用量分別為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%，考察酶用量對花青素含量的影響。每個水平均做3個平行。

1.3.5 Box-Behnken試驗設計

在單因素試驗的基礎上，確定各因素的最佳水平范圍。以液料比值（A）、超聲功率（B）、超聲時間（C）、酶用量（D）為自變量，以花青素含量為響應值，其響應面因素試驗水平見表1，響應面試驗設計及結果見表2。

表1 響應面因素試驗水平

表2 響應面試驗方案及結果

1.3.6 花青素抗氧化活性分析

1.3.6.1 DPPH自由基清除率的測定

將花青素分別配成質量濃度為0.05，0.1，0.15，0.2，0.25和0.3 mg/mL的花青素溶液。用2.0 mL不同濃度的花青素和VC溶液，加入2.0 mL DPPH乙醇溶液（0.2 mmol/L），放置30 min，測定DPPH自由基清除率，按式（2）計算[12]。

式中：A為樣品溶液的吸光度；A1為樣品溶液本底吸光度；A0為空白對照溶液吸光度。

1.3.6.2 ABTS自由基清除率的測定

將50 mL的ABTS溶液（2 mmol/L）與200 mL的過硫酸鉀（70 mmol/L）混合，在4 ℃下放置12 h，并用無水乙醇稀釋。取花青素浸提液和VC溶液各0.1 mL，質量濃度分別為0.05，0.1，0.15，0.2，0.25和0.3 mg/mL，再加入1.9 mL的ABTS自由基溶液，在暗處靜置15 min，按式（3）進行ABTS自由基清除率的計算[12]。

式中：A0為樣品本底的吸光度；A為樣品溶液在波長734 nm處測定的吸光度；A空為用無水乙醇代替樣品在波長734 nm處測定的吸光度。

1.3.7 數據處理

使用Design Expert 13進行響應面分析。使用Origin Pro 2021軟件對數據進行繪制圖表[13]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 液料比值對黑枸杞花青素提取量的影響

如圖1所示，液料比值在2.5～5 mL/g時，黑枸杞花青素含量隨溶劑用量的增大而升高，液料比值在5～ 12.5 mL/g時，花青素含量呈緩慢下降狀態，在5 mL/g時達到最高值，為5.50 mg/g。這可能是因為溶劑太少，花青素不能全部溶出，而在溶劑到達一定的濃度后，黑枸杞花青素就會充分溶出，繼續增加溶劑，花青素含量保持一定，考慮在實際生產中過大的液料比值會消耗大量溶劑[14]，所以選取液料比值2.5，5和7.5 mL/g進行下一步的響應曲面優化試驗。

圖1 不同液料比值對黑枸杞花青素提取量的影響

2.1.2 超聲功率對黑枸杞花青素提取量的影響

如圖2所示，超聲功率在100～200 W時，花青素含量呈上升狀態。超聲功率在200～300 W范圍內，隨著超聲功率的不斷增加，黑枸杞花青素含量呈明顯下降狀。在200 W時，花青素含量達到最高，為5.43 mg/g，可能是由于超聲功率在100～200 W時，隨著超聲功率的增加，黑枸杞粉末的內部結構逐步被破壞，將花青素暴露在溶劑中[15-16]。繼續增大超聲功率會使已暴露在溶劑中的花青素進一步破壞，導致花青素含量下降。所以選取超聲功率150，200和250 W進行響應面優化試驗。

圖2 超聲功率對花青素含量的影響

2.1.3 超聲時間對黑枸杞花青素提取量的影響

如圖3所示，超聲波時間在10～25 min時，隨著超聲波處理時間的增加，黑枸杞花青素的含量逐漸提高，當超聲波時間為25 min時，黑枸杞花青素含量達到最大，為5.82 mg/g，而后隨超聲波作用時間增加，黑枸杞花青素含量呈下降趨勢，可能是由于隨著超聲波作用時間增加，黑枸杞花青素溶出量增多，到一定時間，花青素的結構被破壞，使其含量降低。所以，選擇超聲時間20，25和30 min進行響應面試驗。

圖3 超聲時間對花青素含量的影響

2.1.4 酶用量對黑枸杞花青素提取量的影響

如圖4所示，當酶用量在0.1%～0.3%之間時，黑枸杞花青素含量隨酶用量的增加而升高，當酶用量在0.3%時，黑枸杞花青素含量達到最大，為5.97 mg/g，之后隨著酶用量的增大，黑枸杞花青素提取含量保持一定，可能是因為果膠酶增加時，黑枸杞中果膠被溶解，花青素被釋放出來，隨著果膠酶添加量增加，花青素已充分釋放，無法獲得更多花青素[17]。因此，選取酶用量0.2%，0.3%和0.4%進行響應面試驗。

圖4 酶用量對花青素含量的影響

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 模型建立

采用Design-Expert 13進行了響應曲面設計，并對其進行了分析，試驗方案及結果見表2。

通過回歸擬合，得到了該模型的二次多項式：

回歸模型的方差及顯著性分析見表3。由表3可看出，此模型P＜0.000 1，達到了極顯著的水平，而失擬項P為0.093 1（P＞0.05），沒有顯著性，這說明此模式擬合程度較好，R2=0.981 0，表明利用所建立模型對試驗結果的擬合精度達到98.1%，且試驗誤差小，模型具有較高的可信度。因此，可利用所建模型對黑枸杞花青素提取含量進行分析與預測。

表3 回歸模型的方差及顯著性分析結果

由表3還可看出：模型中一次項B、D，二次項A2、B2、C2、D2，交互項AB、BC、CD對黑枸杞花青素含量影響極顯著（P＜0.01）；交互項AB、BD對黑枸杞花青素含量的影響顯著（P＜0.05）；從F值的大小來看，各個因素對黑枸杞花青素提取含量的作用大小是D（酶用量）＞B（超聲功率）＞C（超聲時間）＞A（液料比值）。

2.2.2 響應面曲線結果

各因素間交互作用的響應面曲線結果如圖5所示，響應面曲線的陡度可以很好地反映對花青素提取量的影響，坡度越陡，二者間的交互作用越強；坡度越緩，交互作用對花青素提取率的影響越小。由圖5可知，響應曲面的陡度次序為CD＞AB＞BC＞AD＞BD＞AC，與表3方差分析結果一致。

圖5 各因素對花青素提取量交互作用響應曲面圖

2.2.3 驗證試驗

利用Design Expert 13對回歸方程進行分析可知，黑枸杞花青素最佳提取工藝條件為液料比值4.979 2 mL/g、超聲功率185.679 W、超聲時間25.508 3 min、酶用量0.333 652%。以此工藝條件為基礎，黑枸杞花青素含量的預測值為7.075 77 mg/g?？紤]到實際操作的可行性，將上述最佳工藝條件修正為液料比值5 mL/g、超聲功率200 W、超聲時間25 min、酶用量0.3%。進行3次平行試驗，黑枸杞花青素含量的平均值為7.0±0.325 mg/g，與理論預測差1.07%，結果表明，利用此模型優選出的最優提取條件具有穩定、可靠性，對生產實踐有一定的指導意義。

2.3 黑枸杞花青素抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH自由基能力

如圖6所示，黑枸杞花青素和VC溶液對DPPH自由基的清除率都隨著濃度的增加而逐漸增強。黑枸杞花青素濃度為0.30 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除率達到81.83%。同時從圖6可以看出黑枸杞花青素清除DPPH的能力明顯高于同濃度的VC溶液。

圖6 不同濃度的黑枸杞花青素對DPPH自由基清除率

2.3.2 清除ABTS自由基能力

如圖7所示，黑枸杞花青素及VC溶液對ABTS自由基清除作用隨著其濃度的升高呈逐步升高的趨勢。黑枸杞花青素濃度為0.30 mg/mL時，其抗ABTS自由基清除能力可達67.82%。黑枸杞花青素清除ABTS的能力整體略高于同濃度的VC溶液，且同濃度的黑枸杞花青素清除DPPH自由基能力高于清除ABTS自由基能力。

圖7 不同濃度的黑枸杞花青素對ABTS自由基清除率

3 結論

以黑枸杞為原料，利用酶促、超聲波技術提取花青素，通過單因素試驗、響應面法優化得到最佳提取工藝：液料比值5 mL/g、超聲功率200 W、超聲時間25 min、酶用量0.3%。在此條件下，黑枸杞花青素含量的平均值為7.03±0.325 mg/g。抗氧化試驗結果表明黑枸杞花青素具有較強的抗ABTS和DPPH自由基活性。結果表明，酶促及超聲波技術提取黑枸杞花青素具有顯著協同作用，可以明顯增加花青素的提取量，縮短提取時間?；谝陨涎芯?，黑枸杞花青素具有較好的抗氧化活性，為黑枸杞花青素資源的進一步開發和利用提供一定的試驗依據。