基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接顛倒瀉心湯治療慢性萎縮性胃炎的作用機(jī)制

劉 姣 劉卿輝 游運(yùn)舸

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis, CAG）是由于胃黏膜上皮反復(fù)遭受炎癥或其他刺激導(dǎo)致胃腺萎縮，黏膜層變薄，腺體數(shù)目減少，歸屬于胃癌前狀態(tài)[1]。胃癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，延緩或逆轉(zhuǎn)Correa 模式（萎縮性胃炎-腸化生-異型增生-胃癌）[2]是預(yù)防胃癌發(fā)生發(fā)展的重要措施。有研究發(fā)現(xiàn)，CAG 患者胃黏膜的血流灌注量相對(duì)淺表性胃炎患者更低，提示胃黏膜腺體萎縮可能與胃內(nèi)血流灌注低相關(guān)[3]，胃黏膜胃鏡下表現(xiàn)是胃腑氣血是否充盛的直接體現(xiàn)，CAG 胃鏡下可見(jiàn)黏膜皺襞變平，血管顯露，胃黏膜紅白相間，以白為主，伴有結(jié)節(jié)狀或顆粒樣表現(xiàn)[4]。“胃黏膜以白為主”是脾胃虛弱、胃絡(luò)失養(yǎng)之象，為CAG 中醫(yī)病理基礎(chǔ)；“結(jié)節(jié)狀或顆粒樣改變”可歸屬為“胃內(nèi)癥瘕”。有學(xué)者提出胃癌前病變即微癥瘕，微者小也，此微癥瘕為極小癥瘕，非肉眼所能見(jiàn)也[5]。

CAG 常呈虛實(shí)夾雜、本虛標(biāo)實(shí)之象，以脾胃虛弱為本，氣滯痰凝血瘀為標(biāo)。血瘀是CAG 久病的主要病機(jī)[6]，在胃黏膜萎縮演化成胃癌的過(guò)程中起著重要作用。在CAG“升降失司、氣血失和”的中醫(yī)病機(jī)基礎(chǔ)上，再靈活運(yùn)用“微癥瘕”理論，將半夏瀉心湯與顛倒木金散聯(lián)合起來(lái)，組成顛倒瀉心湯治療CAG。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接就顛倒瀉心湯治療CAG 的作用機(jī)制進(jìn)行分析。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 顛倒瀉心湯藥物活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選

分別對(duì)顛倒瀉心湯中的黨參、大棗、甘草、法半夏、黃芩、黃連、干姜、木香、郁金、莪術(shù)10 種藥物使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）進(jìn)行檢索，設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18，獲得有效成分后通過(guò)其MOL.ID 號(hào)搜尋單味藥成分作用靶點(diǎn)。利用uniprot（http://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載化合物數(shù)據(jù)表格，匹配靶點(diǎn)基因名。最后將化學(xué)成分的相關(guān)靶點(diǎn)蛋白利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)其進(jìn)行注釋。篩選掉沒(méi)有靶點(diǎn)的無(wú)效成分。

1.2 篩選疾病相關(guān)靶點(diǎn)和顛倒瀉心湯治療CAG 的潛在靶點(diǎn)

在GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入關(guān)鍵詞“Chronic Atrophic Gastritis”，查找CAG 疾病相關(guān)靶點(diǎn)，剔除重復(fù)基因，合并后即為本研究的疾病靶點(diǎn)。運(yùn)用Venny 2.1 在線繪圖工具將“1.1”和“1.2”獲取的基因取交集后，最終獲得顛倒瀉心湯治療CAG的潛在靶點(diǎn)。

1.3 中藥成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)、藥物成分?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0作圖軟件，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，根據(jù)基因的連接數(shù)量（Degree 值）調(diào)整靶點(diǎn)圖形、顏色、透明度和大小，構(gòu)造“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String 平臺(tái)，獲取蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.9.0 軟件中，選擇“network Analyzer”，得到網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)。然后把下載好的TSV 文件導(dǎo)入cytoscape 軟件做PPI 圖，其中節(jié)點(diǎn)越大、顏色越紅代表Degree 值越大，根據(jù)Degree 值篩選出排名前10 的核心靶點(diǎn)。

1.5 基因本體（gene ontology, GO）生物過(guò)程和京都基因與基因組百科全書(shū)（kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析

利用Bioconductor 在R 軟件內(nèi)安裝運(yùn)行Pathview、clusterProfiler 和Stringin 程序包，對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程的GO、KEGG 通路富集分析，得到的數(shù)據(jù)中，pvalue 值越大表示富集程度越大，選取排名前10 的GO 值、排名前15 及與疾病相關(guān)的KEGG 值繪制條形圖。

1.6 分子對(duì)接

將拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)排名靠前的大分子和小分子進(jìn)行分子對(duì)接。蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)由 alphafold 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://alphafold.ebi.ac.uk/）獲取。對(duì)接小分子庫(kù)由搜索TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中的中藥獲取并建立。運(yùn)用Autodock 程序完成分子對(duì)接后，將結(jié)果導(dǎo)入pymol 進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 顛倒瀉心湯藥物活性成分及靶點(diǎn)的篩選

共篩選得到234 種藥物成分，刪除70 種無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)蛋白的化合物，將12 種多藥物共有成分去重整合后，得到141 種藥物活性成分。在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)141 種藥物有效成分MOL.ID 進(jìn)行搜索，共獲得2 262 個(gè)藥物作用的靶點(diǎn)蛋白，經(jīng)過(guò)去重處理后，剩余236 個(gè)。利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)匹配236 個(gè)靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)基因名。

2.2 篩選疾病相關(guān)靶點(diǎn)和顛倒瀉心湯治療CAG 的潛在靶點(diǎn)

從Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)查找篩選CAG 疾病靶點(diǎn)，去重整合后，最后得到933 個(gè)疾病靶點(diǎn)，與236 個(gè)藥物作用靶點(diǎn)進(jìn)行韋恩分析，最終得到101 個(gè)交集靶點(diǎn)（圖1），作為顛倒瀉心湯治療CAG 的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖1 “中藥靶標(biāo)基因-疾病基因”韋恩圖

2.3 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了進(jìn)一步探索顛倒瀉心湯治療CAG 的作用機(jī)制，將101 個(gè)潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)與236 個(gè)藥物作用的靶點(diǎn)蛋白比對(duì)，去除無(wú)對(duì)應(yīng)的藥物成分，最終獲得16 種藥物活性成分，將其與101 個(gè)交集靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 軟件，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），圖中不規(guī)則四邊形節(jié)點(diǎn)代表疾病名稱(chēng)、菱形節(jié)點(diǎn)代表藥物靶點(diǎn)及疾病交集靶點(diǎn)、正六邊形節(jié)點(diǎn)代表藥物活性成分。選擇Analyze network 選項(xiàng)分析網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)，最終得到各節(jié)點(diǎn)的度值。藥物活性成分對(duì)應(yīng)的交集靶點(diǎn)越多度值越高，按照度值高低選擇排名前5 的藥物活性成分作為顛倒瀉心湯治療CAG 的核心成分（圖3）。

圖2 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

圖3 核心成分

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過(guò)String 平臺(tái)獲取蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 作圖軟件進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建（圖4），該圖共有96 個(gè)節(jié)點(diǎn)和456 條邊。節(jié)點(diǎn)越大、顏色越紅代表Degree 值越大。根據(jù)Degree 值篩選出前10的核心靶點(diǎn)（圖5）。

圖4 PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖5 核心靶點(diǎn)

2.5 GO 功能富集分析

GO 富集分析共獲得4 530 條，其中生物過(guò)程（BP）3 915 條、細(xì)胞組成（CC）251 條、分子功能（MF）364 條，根據(jù)富集的基因數(shù)量各取排名前10的條目進(jìn)行可視化，圖中條形長(zhǎng)度代表富集的基因數(shù)量。見(jiàn)圖6。

圖6 GO 富集結(jié)果

2.6 KEGG 通路富集分析

共獲得符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的條目232 條，按照P值進(jìn)行排序，選取基因數(shù)前15 的條目及與CAG 密切關(guān)聯(lián)的MAPK、JAK-STAT、胃癌、PI3K-Akt 及幽門(mén)螺桿菌感染中的信號(hào)通路進(jìn)行可視化，圖中條形的長(zhǎng)度代表相應(yīng)條目所富集基因數(shù)量（圖7）。涉及通路包括脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17 信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、肝炎等。

圖7 KEGG 通路富集結(jié)果

2.7 分子對(duì)接

從“圖3”中選取前3 的核心成分槲皮素（Quercetin）、黃芩素（baicalein）和β-胡蘿卜素（beta-carotene），從“圖5”中選擇度值排名前3 的靶蛋白STAT3、JUN 和AKT1，將其分別進(jìn)行結(jié)合能力預(yù)測(cè)（表1），形成的對(duì)接模型的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol，說(shuō)明結(jié)合活性較好。

表1 關(guān)鍵靶點(diǎn)與成分對(duì)接結(jié)果

3 討論

CAG 屬于中醫(yī)學(xué)“胃痞”，中焦虛弱，外邪漸深，由氣入血，直至胃絡(luò)，最終形成“胃內(nèi)癥瘕”。胃絡(luò)失養(yǎng)，胃腺萎縮，胃黏膜變薄，日久成萎。其中，胃絡(luò)瘀阻是本病的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)。若病理提示腸化生或異型增生，則更應(yīng)重視，其性乖戾，久稽于胃，若不積極治療，可惡變成癌。

CAG 的臨床治療目標(biāo)應(yīng)在改善患者臨床癥狀的基礎(chǔ)上，盡量延緩或阻滯“炎-癌”轉(zhuǎn)化進(jìn)程[7]。顛倒瀉心湯中郁金辛苦，辛能散能行，苦能燥能泄，且又入血分，能行氣解郁，活血止痛，以化瘀為主；木香味辛性溫，辛散溫通，主入氣分，行氣止痛，調(diào)中導(dǎo)滯，以理氣為要，二藥相須配伍，疏肝行氣、活血通絡(luò)，臨床常用于治療氣滯血瘀之證。黨參、甘草、大棗甘溫益氣，以補(bǔ)脾虛。中虛失運(yùn)，升降失調(diào)，又以半夏散結(jié)除痞、和胃降逆，黃芩、黃連泄熱開(kāi)痞，干姜溫中散寒。此四藥相伍，具有寒熱平調(diào)、辛開(kāi)苦降之效。莪術(shù)消積止痛、破血消癥，現(xiàn)代藥理學(xué)表明，莪術(shù)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)“莪術(shù)油”具有廣泛的抗腫瘤作用[8]，可有效防治癌前病變、腸上皮化生及非典型增生。

藥效成分方面，槲皮素可以促進(jìn)黏膜愈合，發(fā)揮抗炎、抗氧化效用，是一種潛在的抗胃黏膜炎癥的生物活性物質(zhì)[9]；喻春紅等[10]的研究表明采用槲皮素治療后大鼠胃黏膜炎癥顯著減輕，胃黏膜病理明顯轉(zhuǎn)歸，可對(duì)CAG“炎-癌”轉(zhuǎn)化產(chǎn)生防治作用。黃芩素不僅具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗腫瘤等功效[11]，還能通過(guò)抑制細(xì)菌繁殖和減弱細(xì)菌致病力發(fā)揮抗幽門(mén)螺桿菌的作用[12]。黃芩素也能通過(guò)抑制炎癥因子的釋放從而阻斷其對(duì)胃黏膜的損傷[13]。段雲(yún)霄等[14]的研究表明，黃芩素能顯著抑制胃癌HGC-27 細(xì)胞增殖，其作用隨時(shí)間和濃度依賴(lài)性增加。β-胡蘿卜素可以有效改善CAG 的臨床癥狀，并逆轉(zhuǎn)“炎-癌”轉(zhuǎn)化進(jìn)程[15]。已有研究[16]證實(shí)β-胡蘿卜素可以通過(guò)調(diào)控STAT3 等多條信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用。

治療靶點(diǎn)方面，STAT3 是一種轉(zhuǎn)錄因子，也是JAK/STAT 信號(hào)通路的最終蛋白，其可進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮促轉(zhuǎn)錄的作用，研究已證實(shí)STAT3 的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[17]。進(jìn)一步的細(xì)胞生物學(xué)行為的研究結(jié)果表明STAT3 能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[18]。崔姍姍[19]在研究中發(fā)現(xiàn)半夏、黃芩、黃連及干姜均能通過(guò)抑制STAT3 轉(zhuǎn)錄因子下游基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC-7901 凋亡。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[20-21]均證實(shí)了抑制STAT3 信號(hào)通路及以其介導(dǎo)的IL-1β 和TNF-α 促炎因子表達(dá)，可使胃內(nèi)炎癥微環(huán)境得到改善，加快細(xì)胞凋亡，最終達(dá)到治療CAG的目的。駱梅[22]在研究中證實(shí)了JUN 能與DKK1啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)DKK1 啟動(dòng)子的活性，激活DKK1-PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。AKT1 可通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt 等多條信號(hào)通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[23]。李樹(shù)靜等[24]以WNT/β-Catenin 信號(hào)通路為切入點(diǎn)，從細(xì)胞水平證實(shí)了AKT1 可能通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-9 蛋白的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。

結(jié)合“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖分析結(jié)果可知，顛倒瀉心湯可作用于FOS、IL6、TP53、MAPK1、TNF、MAPK3 及MAPK14 等多靶點(diǎn)，其中TP53 不僅是CAG 的關(guān)鍵靶標(biāo)，也是腸化生、不典型增生的監(jiān)測(cè)指標(biāo)[25]。MAPK3 過(guò)度表達(dá)及活化可以使下游STAT3 水平升高，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[26]。TNF-α 和IL6 等炎癥因子過(guò)表達(dá)會(huì)損傷胃黏膜，且表達(dá)程度與損傷程度成正比，可影響CAG的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸[27-28]。

顛倒瀉心湯作用于CAG的癌癥通路有P53、TNF及胃癌通路等；炎癥通路有IL-17 信號(hào)通路、NF-κB、EGFR 及幽門(mén)螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路等；與代謝相關(guān)的通路有脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、AGE-RAGE 信號(hào)通路等；與CAG 密切相關(guān)的有JAK-STAT 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。PI3K-Akt 信號(hào)通路可以調(diào)控細(xì)胞增殖，積極參與腫瘤的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞擴(kuò)散能延緩“炎-癌”轉(zhuǎn)化并減少胃癌細(xì)胞的增殖和分化[29]。MAPK 信號(hào)通路可以調(diào)控多種細(xì)胞的增殖與凋亡[30]。通過(guò)降低胃黏膜中MAPK水平，促進(jìn)CAG 細(xì)胞凋亡，起到治療CAG 的作用。眾多研究發(fā)現(xiàn)CAG 的發(fā)病與炎癥因子密切相關(guān)[31-33]，JAK-STAT 信號(hào)通路可以促進(jìn)IL-6 和TNF-α 等炎癥因子的釋放，導(dǎo)致胃黏膜受損[34]。

綜上所述，顛倒瀉心湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡、免疫炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝、致癌因子等多途徑治療CAG。脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路是KEGG 通路富集分析結(jié)果中基因數(shù)量最多的通路，這與上文提到的CAG“微癥瘕”理論相符，或許可為CAG 下一步研究提供新思路。