聯(lián)合化療的黃芪抗腫瘤給藥時(shí)間點(diǎn)的篩選

鄧曉霞 李清宋 李 影 劉素蘭

國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer, IARC）估算的數(shù)據(jù)[1]顯示，惡性腫瘤已超越心血管疾病等高死亡率慢性疾病，成為全球大多數(shù)國(guó)家和地區(qū)的第一或第二位死因。手術(shù)及放化療是目前腫瘤最常用的治療手段，三者常聯(lián)合使用[2]，但放化療的毒副作用較大[3-4]。

近年來(lái)，隨著對(duì)中藥的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)了一大批抗腫瘤藥物，研究其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供了重要的參考。應(yīng)用中草藥治療和預(yù)防腫瘤成為全世界研究的熱點(diǎn)[5-7]。中醫(yī)藥以其安全、有效、低毒的特點(diǎn)在未來(lái)的抗腫瘤治療領(lǐng)域發(fā)揮著極其重要的作用[8-9]。

黃芪，味甘，性溫，歸肺、肝、脾、腎經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、托毒生津和利水消腫等功效，在臨床上常作為化療的輔助用藥[10-11]。臨床調(diào)研發(fā)現(xiàn)黃芪給藥具有很大的隨機(jī)性：放化療與黃芪同時(shí)使用或放化療后使用黃芪，臨床暫未對(duì)這兩種給藥方式的療效進(jìn)行比較。放化療過程中黃芪的給藥時(shí)間點(diǎn)是否對(duì)其抗腫瘤療效有影響尚無(wú)定論。本研究就黃芪在腫瘤的化學(xué)治療中最佳給藥時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分析?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞

雄性昆明（KM）小鼠135 只，SPF 級(jí)，體重（20±2）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004；H22 肝癌瘤株，由中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心藥理學(xué)科組提供。

1.2 藥物與試劑

黃芪顆粒，廣東一方制藥有限公司，批號(hào)：404021T；5-氟尿嘧啶（5-FU）注射液，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào)：FA150503；0.9%氯化鈉注射液，江西科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)：D15041604-1。

1.3 儀器設(shè)備

超純水儀，默克密理博 Milli-Q Advantage A10；十萬(wàn)分之一天平，梅特勒，型號(hào)：MS205DU；EVC動(dòng)物飼養(yǎng)裝置，蘇州猴皇動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)備科技有限公司；BC-2800 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀，深圳邁瑞有限公司；RM2255 型全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)有限公司；NiKon Ci-S 正置顯微鏡，日本尼康公司。

1.4 分組、造模及給藥

1.4.1 分組 135 只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后，稱重，隨機(jī)分為9 組，每組15 只，分別為正常組（C 組）、模型組（M 組）、5-FU 組（25 mg/（kg?d））、化療同時(shí)給予黃芪高、中、低劑量組（5FU+Hh、5FU+Hm、5FU+Hl，5FU 劑量同上，黃芪5.6 g/（kg?d）、2.8 g/（kg?d）、1.4 g/（kg?d））、化療后給予黃芪高、中、低劑量組（5-FU 后+Hh、5-FU 后+Hm、5-FU 后+Hl，5FU、黃芪劑量同上）。小鼠飼養(yǎng)于室溫25 ℃，光照和黑暗各12 h 的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)室中。

1.4.2 造模 將肝癌細(xì)胞株H22 接種于健康KM 小鼠腹腔中，待其充滿腹水后無(wú)菌抽取含有H22 肝癌細(xì)胞的腹水，顯微鏡下調(diào)整細(xì)胞濃度為1.50×107個(gè)/ml，于小鼠右側(cè)前肢腋窩皮下注射0.2 ml 的H22 細(xì)胞懸液。

1.4.3 給藥 造模次日開始給藥。第1～7 天，C 組與M 組注射0.9%氯化鈉注射液，灌胃雙純水；5-FU組和化療后給予黃芪高、中、低劑量組注射5-FU，灌胃雙純水；化療同時(shí)給黃芪高、中、低劑量組注射5-FU，灌胃相應(yīng)濃度的黃芪顆粒溶液。第8～14 天，C 組、M 組和5-FU 組灌胃雙純水，化療同時(shí)給黃芪高、中、低劑量組和化療后給予黃芪高、中、低劑量組灌胃相應(yīng)濃度的黃芪顆粒溶液。1 次/d，連續(xù)給藥14 d，每隔1 天稱重1 次。造模后第3 天起，每隔1天測(cè)量腫瘤大小，腫瘤體積=1/2×a×b2，a 為長(zhǎng)徑，b 為短徑。

1.5 動(dòng)物處理、標(biāo)本采集

實(shí)驗(yàn)第14 天晚上禁食不禁水，次日眼球取血，后用頸椎脫臼法處死小鼠，快速剝?nèi)∧[瘤組織、胸腺組織、脾臟，腫瘤組織存放于4%多聚甲醛中。胸腺指數(shù)（脾指數(shù)）=胸腺重量（脾臟重量）/小鼠體重×100%。

1.6 HE 染色

取出已在4.2%多聚甲醛中浸泡48 h 的腫瘤組織，用低速流動(dòng)的自來(lái)水沖洗36 h，經(jīng)過脫水-透明-浸蠟-包埋-切片后，HE 染色，光鏡下觀察各組腫瘤組織的病理變化。

1.7 全血檢測(cè)

將現(xiàn)取的血液用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)各組白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s 表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪對(duì)荷瘤小鼠一般狀況的影響

M 組有化膿和死亡現(xiàn)象，小鼠雙眼無(wú)神，反應(yīng)遲鈍，皮毛稀少干枯，食量減少，且腫瘤生長(zhǎng)迅速；5-FU 組有化膿和死亡現(xiàn)象，小鼠雙眼無(wú)神，反應(yīng)和皮毛等未見明顯改善，活動(dòng)度降低，瘤體較M 組有減小趨勢(shì)；5-FU+H 組和5-FU 后+H 組小鼠的生長(zhǎng)狀況良好，無(wú)死亡現(xiàn)象，毛發(fā)有光澤，反應(yīng)較靈敏，體重稍有增加，瘤體生長(zhǎng)明顯減緩，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，5-FU 后+H 組小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)明顯優(yōu)于5-FU+H 組。

2.2 黃芪對(duì)荷瘤小鼠體重的影響

M 組由于腫瘤生長(zhǎng)迅速，荷瘤小鼠體重持續(xù)偏高；化療期間（前7 d），各給藥組荷瘤小鼠體重?zé)o明顯差異，平穩(wěn)緩慢增加；化療結(jié)束后，各給藥組小鼠前期體重變化較小，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，荷瘤小鼠體重明顯增加，且給藥組中以5-FU 后+H 高劑量組、5-FU 后+H 中劑量組體重最高。從變化趨勢(shì)可推測(cè)出，在一定時(shí)間內(nèi)，隨著時(shí)間的推移5-FU 組荷瘤小鼠的體重增加趨勢(shì)逐漸減緩，其他給藥組荷瘤小鼠體重穩(wěn)步增加。見圖1。

圖1 黃芪對(duì)荷瘤小鼠體重的影響

2.3 黃芪對(duì)荷瘤小鼠腫瘤體積的影響

與M 組比較，各給藥組小鼠腫瘤體積明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與5-FU 組比較，除5-FU 后+Hm 組（H 組）小鼠腫瘤體積明顯減?。≒＜0.05）外，其他各組均無(wú)顯著差異。見圖2。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)H 組進(jìn)行探究。

圖2 黃芪對(duì)荷瘤小鼠腫瘤體積的影響

2.4 HE 染色

如圖3 所示：M 組腫瘤細(xì)胞核小、量大、色深，并大量向周圍組織（包括骨骼?。┣忠u，明顯破壞周圍組織，周圍組織中新生血管豐富；與M 組比較，5-FU 組、H 組的腫瘤細(xì)胞對(duì)周圍正常組織的侵襲程度依次逐漸減弱，新生血管依次逐漸減少，且H 組中形成了明顯的包膜、新生血管少且管徑小。

圖3 腫瘤組織HE 染色

2.5 黃芪對(duì)荷瘤小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的影響

與M 組比較，5-FU 組胸腺指數(shù)和脾指數(shù)明顯下降（P＜0.05）；5-FU 組比較，H 組胸腺指數(shù)和脾指數(shù)明顯升高（P＜0.05）。見圖4。

圖4 黃芪對(duì)荷瘤小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的影響

2.6 黃芪對(duì)荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的影響

與M 組比較，5-FU 組淋巴細(xì)胞顯著降低（P＜0.05）、中性粒細(xì)胞顯著升高（P＜0.05）；與5-FU 組比較，H 組的淋巴細(xì)胞顯著升高（P＜0.05）、中性粒細(xì)胞明顯降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 黃芪對(duì)荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的影響

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為肝癌屬于“肝積”“積聚”等病證范圍，其主要病機(jī)為正虛邪實(shí)、本虛標(biāo)實(shí)。正如《諸病源候論》中言：“積聚者，乃陰陽(yáng)不和，臟腑虛弱，受于風(fēng)邪，搏于臟之氣所為也?！庇秩纭峨s病源流犀燭》言：“壯盛之人，必?zé)o積聚。必其人正氣不足，邪氣留著，而后患此?！闭f(shuō)明正氣不足是腫瘤（疾?。┌l(fā)生的內(nèi)在因素，是根本之所在；而外邪是誘發(fā)腫瘤（疾病）的重要條件，是誘因；故扶正祛邪、攻補(bǔ)兼施為其主要治療原則[12]。

葉淑芳等[13]收集了于2019 年1—12 月在廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院就診的腫瘤患者的用藥處方，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用藥頻次排名前15 的中藥以補(bǔ)氣藥和補(bǔ)血藥為主。黃芪作為最常見的抗腫瘤補(bǔ)氣藥之一，其抗腫瘤作用機(jī)制包括調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗氧化等[14]。腫瘤大小是量化藥物是否具有抗腫瘤作用的基礎(chǔ)指標(biāo)[15]。本研究綜合腫瘤大小及荷瘤小鼠生命質(zhì)量探索黃芪聯(lián)合化療治療腫瘤的最佳給藥時(shí)間。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪可改善荷瘤小鼠的生命質(zhì)量，化療后給予黃芪可進(jìn)一步抑制腫瘤的生長(zhǎng)；HE 染色結(jié)果表明，黃芪可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、減少血管新生及對(duì)周圍正常組織的侵襲。

5-FU 是目前常用的腫瘤化療藥物之一，效果顯著，但其嚴(yán)重的毒副作用-胃腸道反應(yīng)（惡心、嘔吐）、免疫器官指數(shù)降低、免疫功能抑制、骨髓抑制等，亦不可忽視[3-4]。因此，提高免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體自身抗腫瘤免疫反應(yīng)在腫瘤治療中顯得至關(guān)重要。中性粒細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)中分布最廣泛的白細(xì)胞之一，是機(jī)體的第一道天然防線，既是炎癥形成的早期標(biāo)志，還能參與機(jī)體免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)；淋巴細(xì)胞是體積最小的白細(xì)胞，具有免疫識(shí)別功能，通過啟動(dòng)細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，是腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵細(xì)胞。胸腺和脾臟是機(jī)體重要的淋巴器官，其功能與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過剝離胸腺和脾臟，采集全血，獲得了胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，注射5-FU 后小鼠出現(xiàn)免疫功能低下狀態(tài)；化療后給予黃芪，胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、淋巴細(xì)胞明顯升高，中性粒細(xì)胞明顯降低，說(shuō)明黃芪可改善5-FU 引起的免疫功能降低、炎性環(huán)境。

綜上所述，黃芪可增強(qiáng)5-FU 的抗腫瘤作用，且化療后給予黃芪效果更加明顯，其抗腫瘤作用可能與黃芪能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、減少血管新生、改善炎性環(huán)境有關(guān)。