基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究活血接骨膠囊治療閉合性腰椎骨折的作用機制

鄭維宣 范鳴翔 伍英杰 劉振洋 羅建松 許和貴

骨折是指骨的完整性或連續(xù)性遭受破壞，腰椎骨折是脊柱外傷中最常見的一種骨折類型[1]。本病多發(fā)于成年人及存在骨質(zhì)疏松癥的老年人，尤其以絕經(jīng)后的女性為高發(fā)病人群。隨著城市化的快速發(fā)展，在我國腰椎骨折的發(fā)病率逐漸上升，不僅影響患者的生命質(zhì)量，還帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)[2]。腰椎骨折主要以閉合性腰椎骨折為主，主要臨床表現(xiàn)為腰背局部疼痛、壓痛、叩擊痛，腰部活動受限，嚴(yán)重者可能會出現(xiàn)大小便失禁及下肢截癱[3]，若不及時處理容易導(dǎo)致休克。對于閉合性腰椎骨折患者主要采用手術(shù)治療[4]，解除脊髓或神經(jīng)壓迫，糾正畸形并恢復(fù)脊椎穩(wěn)定性，須及早進行治療避免造成進一步的損傷。患者術(shù)后容易出現(xiàn)術(shù)區(qū)傷口疼痛、腫脹，老年患者傷口愈合緩慢。腰椎骨折術(shù)后患者配合中藥活血接骨膠囊內(nèi)服能有效改善血液循環(huán)，減輕腰背部疼痛，促進骨折加速愈合，改善脊柱活動度，提高患者日常活動能力。活血接骨膠囊是由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科時光達教授根據(jù)臨床經(jīng)驗研制后經(jīng)本院改良而成[5]。活血接骨膠囊主要由蘇木、透骨草、土鱉蟲、自然銅、川芎、丹參、骨碎補、熟地黃等中藥組成，具有續(xù)筋接骨、消腫止痛、活血祛瘀等功效，主治跌打損傷、筋傷骨折、瘀腫疼痛等[6]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，活血接骨膠囊能夠減輕炎癥反應(yīng)，增強成骨細胞和破骨細胞的活性，促進傷口愈合[7]。然而，活血接骨膠囊治療閉合性腰椎骨折的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究目前尚未見相關(guān)報道。基于此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)就活血接骨膠囊治療閉合性腰椎骨折的作用機制進行分析。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 獲取活血接骨膠囊的活性成分及靶點

于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中分別輸入“蘇木”“透骨草”“土鱉”“自然銅”“川芎”“丹參”“骨碎補”“熟地黃”，限定OB≥30%、DL≥0.18，再結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）、CNKI 數(shù)據(jù)庫（https://www.cnki.net/）、BATMAN 數(shù)據(jù)庫檢索并篩選出8 味中藥的活性成分及靶點。限定物種為“Homo sapiens”，采用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（http://beta.uniprot.org/）篩選出活血接骨膠囊活性成分對應(yīng)的靶點，轉(zhuǎn)換成與之相對應(yīng)的基因名稱，刪減重復(fù)項并整合，最終獲得活血接骨膠囊的活性成分及其靶點數(shù)據(jù)集。

1.2 獲取疾病的靶點

以“Closed lumbar fracture”為關(guān)鍵詞在Genecards 數(shù)據(jù)庫（http://www.genecards.org/）和OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）中檢索閉合性腰椎骨折的靶點，將上述獲得的閉合性腰椎骨折的靶點進行整合，刪除重復(fù)項后即獲得閉合性腰椎骨折疾病的靶點集。

1.3 構(gòu)建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

將篩選出的活血接骨膠囊活性成分的作用靶點與閉合性腰椎骨折疾病靶點導(dǎo)入在線網(wǎng)站venny 2.1，繪制韋恩圖并篩選出交集靶點。采用cytoscape 3.8.2軟件將中藥及其活性成分和與之對應(yīng)的靶點構(gòu)建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“1.3”項下篩選出的交集靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapiens”，置信度≥0.9，隱藏沒有相互連接的邊，導(dǎo)出.tsv 文件，采用cytoscape 3.8.2 軟件對.tsv 文件進行可視化分析，繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 核心靶點的篩選

將String 數(shù)據(jù)庫中的.tsv 文件導(dǎo)入cytoscape 3.8.2 軟件，計算拓撲參數(shù)，選擇degree 值大于4 倍中位數(shù)，介度中心性（BC）和接近中心性（CC）均大于其相應(yīng)中位數(shù)的節(jié)點作為核心靶點。

1.6 基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路分析

將“1.5”項下篩選出的核心靶點，導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫對其進行GO 富集分析和KEGG 信號通路分析，可以獲得活血接骨膠囊治療閉合性腰椎骨折的GO 生物學(xué)過程和關(guān)鍵信號通路。

2 結(jié)果

2.1 活血接骨膠囊的活性成分及靶點

通過數(shù)據(jù)庫結(jié)合文獻檢索共篩選出活性接骨膠囊117 個活性成分，其中蘇木有21 個，透骨草有13個，土鱉有1 個，自然銅有1 個，川芎有6 個，丹參有58 個，骨碎補有15 個，熟地黃有2 個；通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫，共篩選出654 個藥物靶點。

2.2 疾病的靶點

采用Genecards 數(shù)據(jù)庫和OMIM 數(shù)據(jù)庫共得到閉合性腰椎骨折疾病靶點2 662 個，與活血接骨膠囊的共同靶點有264 個（圖1）。

圖1 活血接骨膠囊與閉合性腰椎骨折靶點的交集

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)

將“1.3”項下的活血接骨膠囊與閉合性腰椎骨折的交集靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，將其結(jié)果的.tsv 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件得出節(jié)數(shù)點為247、邊數(shù)為8 734，根據(jù)Degree 值大小繪制其PPI 網(wǎng)絡(luò)。見圖2。

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.4 “藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

將活血接骨膠囊中的各味中藥、活性成分、靶點導(dǎo)入cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)（圖3），結(jié)果顯示：該網(wǎng)絡(luò)共有788 個節(jié)點、1 987 條邊。網(wǎng)絡(luò)圖中顯示，同一活性成分可作用于不同靶點，而不同活性成分也可共同作用于同一靶點，體現(xiàn)了活血接骨膠囊治療疾病時具有多成分多靶點協(xié)同作用的特點。

圖3 “藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

2.5 核心靶點

運用Cytoscape 3.8.2 軟件對交集靶點進行拓撲分析，并選取Degree＞40 的候選核心靶點29 個，最后采用BC＞9.65，CC＞0.69 篩選出STAT3、JUN、MAPK1、NR3C1、FOS、HDAC1、MAPK14、SP1、RELA、TP53 10 個核心靶點。見圖4。

圖4 核心靶點篩選流程

2.6 GO 富集分析

活血接骨膠囊治療閉合性腰椎骨折的GO 生物過程分析結(jié)果顯示，涉及共132 條GO 生物過程，包括生物學(xué)過程（BP）79 條，細胞組成（CC）16 條，分子功能（MF）37 條，繪制各類別前10 條目的柱狀圖見圖5。結(jié)果顯示，主要涉及了藥物反應(yīng)、蛋白結(jié)合、基因的正表達、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)控、酶的結(jié)合、細胞因子活性等生物學(xué)過程，體現(xiàn)了活血接骨膠囊可通過調(diào)控多個復(fù)雜的生物過程來治療閉合性腰椎骨折。

圖5 GO 富集分析柱狀圖

2.7 KEGG 信號通路分析

KEGG 信號通路分析結(jié)果顯示：活血接骨膠囊治療閉合性腰椎骨折的信號通路有96 條，按照-lgP值排序，選取前30 條通路繪制靶點通路分類圖見圖6，結(jié)果顯示主要包括TNF 信號通路、TOLL 樣受體信號通路、AGE-RAGE 通路、MAPK 信號通路、IL-17通路、癌癥通路、乙肝通路、Th17 細胞等信號通路。

圖6 KEGG 信號通路

同一靶點可調(diào)控不同的信號通路如：STAT3、JUN、MAPK1、NR3C1、FOS、HDAC1、MAPK14、SP1、RELA、TP53 等靶點可參與調(diào)控TNF 信號通路、TOLL 樣受體信號通路、AGE-RAGE 通路、MAPK信號通路、IL-17 通路、癌癥通路、乙肝通路、Th17細胞等，提示活血接骨膠囊通過作用于多條通路來治療閉合性腰椎骨折。見圖7。

圖7 信號通路桑葚圖和氣泡圖

3 討論

活血接骨膠囊主要含有蘇木、透骨草、土鱉蟲、自然銅、川芎、丹參、骨碎補、熟地黃等中藥材，諸藥合理配伍，具有續(xù)筋接骨、消腫止痛、活血祛瘀等功效，主治跌打損傷、筋傷骨折、瘀腫疼痛等疾病[5-6]。臨床研究發(fā)現(xiàn)蘇木、透骨草、骨碎補具有明顯的抗炎止痛作用，能降低炎癥因子水平從而緩解術(shù)后疼痛及腫脹；土鱉蟲、自然銅兩味中藥具有良好的續(xù)筋接骨作用，配合使用能促進骨折早期愈合；丹參、川芎活血化瘀，具有改善機體血液微循環(huán)作用，祛瘀生新加速骨折部位氣血運行，從而縮短骨折愈合時間；熟地黃滋陰補血，益精填髓，可營養(yǎng)骨骼，使骨變得更堅硬牢固[7]。

腰椎骨折屬于中醫(yī)“骨折病”范疇，主要臨床表現(xiàn)為傷處刺痛腫脹、腰椎活動受限。骨折后常采用內(nèi)固定手術(shù)進行治療，目的是通過重建脊柱穩(wěn)定性，恢復(fù)脊柱功能，改善骨折后臨床癥狀[8]。腰椎骨折使用內(nèi)固定手術(shù)治療的過程易耗傷人體氣血，術(shù)后易導(dǎo)致氣血升降失調(diào)，運行不暢；氣血相互相乘，氣行則血行，氣滯則血瘀；氣不攝血，則血溢脈外形成瘀血，瘀血停留在局部，不通則痛，可見患者術(shù)后傷口處疼痛腫脹。高齡患者本身肝腎虧虛，氣血津液生成匱乏，術(shù)后更容易導(dǎo)致氣血津液不足[9-10]，可見骨折愈合緩慢，如果給予中藥活血接骨膠囊治療能夠有效緩解術(shù)后癥狀。

通過對活血接骨膠囊中的有效成分進行分析發(fā)現(xiàn)，部分化合物如山柰酚、槲皮素、隱丹參酮、木犀草素、芹菜素及雙氫黃酮苷等已被證實具有抗炎鎮(zhèn)痛和促進成骨細胞增殖作用。趙峰等[11]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)山柰酚可上調(diào)miR340-5p 抑制AKT3 表達，從而阻斷AKT3/mTOR 信號通路，抑制星形膠質(zhì)細胞的炎癥，增強自噬，減輕脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠的神經(jīng)性疼痛。山柰酚可通過調(diào)控Wnt/β-catenin 經(jīng)典途徑調(diào)節(jié)骨的發(fā)育和礦化[12]；山柰酚具有促進成骨細胞MG-63 增殖和礦化的作用[13]。槲皮素可通過上調(diào)SATB2 基因的表達促進BMSCs 增殖和成骨分化[14]；槲皮素通過抑制DANCR 的表達促進BMSCs 的增殖和成骨分化[15]；有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素還可通過活性氧抑制MAPK 途徑的激活，影響心肌成纖維細胞增殖來抑制心臟纖維化[16]。木犀草素具有消炎、抗菌、抗病毒等功效，能有效抑制巨噬細胞磷酸化，降低轉(zhuǎn)錄因子NF-kB 的活性，減少脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細胞分泌細胞因子IL-6、TNF-a。其可通過調(diào)控TLR4/NF-κB 途徑減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而治療某些疾病[16]。芹菜素可以促進MC3T3-E1 細胞成骨分化和礦化[17]；芹菜素能促進干細胞成骨分化[18]；芹菜素作為活血補腎方治療骨關(guān)節(jié)炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，能降低骨關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)從而達到治療骨關(guān)節(jié)炎的作用等[19]。雙氫黃酮苷可促進骨骼對鈣離子的吸收，改善血液循環(huán)、新陳代謝，從而促進骨折早期愈合[10]。

通過對活血接骨膠囊PPI 網(wǎng)絡(luò)和富集分析，核心靶點為STAT3、JUN、MAPK1、NR3C1、FOS、HDAC1、MAPK14、SP1、RELA、TP53 等，主要通過干預(yù)TNF信號通路、TOLL 樣受體信號通路、AGE-RAGE 通路、MAPK 信號通路、IL-17 通路、癌癥通路、乙肝通路、Th17 細胞等相關(guān)信號通路治療閉合性腰椎骨折。槲皮素通過調(diào)控ERK1/2-MAPK 信號通路，下調(diào)MAPK mRNA 和蛋白的表達，從而對骨質(zhì)疏松有明顯預(yù)防作用[20]；槲皮素、木犀草素、山柰酚等化合物作為淫羊藿中的活性化合物，作用于多靶點如JUN、IL6、TNF、TP53 調(diào)控多條信號通路治療骨質(zhì)疏松[21]；芹菜素在治療骨折方面的機制可能與調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK 信號通路有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)使用芹菜素處理創(chuàng)傷性骨折大鼠模型，可以減輕大鼠炎癥反應(yīng)并促進骨折愈合[22]。雙氫黃酮苷可通過調(diào)控多通路促進骨折愈合[10]。

綜上所述，活血接骨膠囊中的藥物在治療骨折、筋傷等疾病時，每一味藥物均發(fā)揮著巨大作用，具有顯著臨床療效。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)活血接骨膠囊主要通過TNF 信號通路、TOLL 樣受體信號通路、AGE-RAGE 通路、MAPK 信號通路、IL-17 通路、癌癥通路、乙肝通路、Th17 細胞等途徑治療閉合性腰椎骨折。但本研究只是在分子機制方面進行了探討預(yù)測，具體藥物作用機制仍需進一步相關(guān)實驗進行驗證。