黃芪甲苷調節IL-10/β-EP信號通路對腰椎間盤突出癥模型大鼠神經根損傷的影響

朱倚慧 陳博來 伍澤鑫

腰椎間盤突出癥(LDH)是一種肌肉骨骼疾病,常壓迫脊髓或神經根,引起神經系統癥狀[1]。LDH的臨床表現通常包括受累區域的神經根性疼痛以及感覺和運動功能喪失,通常伴有腰痛[2]。LDH通常采用保守療法治療,手術是目前對保守療法無反應患者的唯一治療選擇[3]。因此,探究LDH的發病機制,尋找更多的有效治療藥物具有重要意義。黃芪甲苷是黃芪水提取物的主要成分之一,由于具有抗氧化、抗炎、抗凋亡特性在神經保護、肝臟保護、抗癌和抗糖尿病中起到積極效果[4]。Rao等[5]發現,黃芪甲苷可以減輕脊髓損傷引起的神經性疼痛。白介素-10(IL-10)/β-內啡肽(β-EP)信號通路在緩解神經痛過程中發揮重要作用,Ali 等[6]發現,激活脊髓小膠質細胞IL-10和β-EP的表達可以減輕神經性疼痛。Wu等[7]也發現,IL-10通過上調脊髓小膠質細胞β-EP表達產生抗損傷作用。本研究探究黃芪甲苷是否可能通過激活IL-10/β-EP信號通路減輕大鼠炎癥反應,進而減輕LDH大鼠神經根損傷。

1 材料與方法

1.1 動物 6周齡SPF級雄性SD大鼠(200～220)g購自廣州銳格生物科技有限公司,生產許可證號：SCXK(粵)2021-0059,本研究已獲得醫院動物倫理委員會的批準。

1.2 主要材料 黃芪甲苷購自上海源葉生物科技有限公司; IL-10/β-EP信號通路抑制劑AS10購自MedChemExpress LLC;白介素-1β(IL-1β)購自上海酶研生物科技有限公司;大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、ELISA試劑盒購自南京萬木春生物科技有限公司;離子鈣接頭蛋白分子1(Iba1)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、IL-10、β-EP抗體購自Abcam;TUNEL細胞凋亡試劑盒購自上海吉至生化科技有限公司。

1.3 LDH模型構建與分組 (1)選取10只大鼠記為假手術組(Sham組),其余大鼠參考文獻[8],手術前,剃掉大鼠背部和腹部毛發,并通過腹膜內注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠。身體左側切開一切口,切口長度3～3.5 cm。在大鼠尾骨的第二和第三尾盤椎間盤之間收獲髓核。切斷L5和L6神經根。將髓核放置在左側L5和L6神經根的頂部。然后,用0.9%氯化鈉溶液清洗傷口,并用無菌紗布包扎。Sham組,除了植入髓核外,手術過程相同。(2)將造模成功大鼠分為LDH組、黃芪甲苷組、 AS10組、黃芪甲苷+ AS10組,每組10只。黃芪甲苷組通過腹腔注射20 mg/kg黃芪甲苷[9]。 AS10組通過腹腔注射0.5 mg/kg IL-10/β-EP信號通路抑制劑AS10[10]。黃芪甲苷+ AS10組通過腹腔注射20 mg/kg黃芪甲苷以及0.5 mg/kg AS10,1次/d,連續注射7 d。Sham組和LDH組給予等量0.9%氯化鈉溶液。

1.4 機械刺激敏感性實驗以及熱刺激敏感性實驗 (1)將大鼠置于透明的亞克力箱子中,然后將箱子放在鐵網上,大鼠30 min適應環境后,然后按從小到大的順序選用(0.2～26 g)壓力值的vonfrey絲由下往上垂直刺激大鼠右后腳外側邊緣皮膚,當大鼠出現回縮后足、舔足以及甩腿等收縮反應時,記錄此時的刺激強度,即為機械縮足閾值(PWT)。(2)將大鼠置于透明的亞克力箱子中,箱子下面放冷/熱盤痛覺測試儀。待大鼠適應環境后,將測試儀熱強度調到45,并對準大鼠右后足底,當大鼠后足出現收縮現象,記錄此時的強度值,即為熱痛閾(TWL)。

1.5 樣本采集 大鼠麻醉后,通過腹主動脈獲取3 mL血液,隨后,取大鼠L2～L3段脊椎背角標本,每組隨機選擇5只大鼠的標本固定于4%多聚甲醛用于制作切片,剩余5只大鼠的標本置于-80℃冰箱用于Western blot實驗。

1.6 ELISA法檢測炎性因子水平 將大鼠血液通過4℃離心機離心獲得上清液后,根據ELISA試劑盒說明書檢測血清中炎性因子TNF-α、IL-1β水平。

1.7 TUNEL染色檢測細胞凋亡 脊椎背角組織制作石蠟切片,將切片經脫蠟后置于乙醇溶液水化,滴加蛋白酶K溶液,用PBS沖洗3次后加入TUNEL反應混合液,DAPI顯色,在光學顯微鏡下觀察,并計數TUNEL陽性細胞的數量。

1.8 免疫熒光染色測定小膠質細胞和星形膠質細胞活性 將獲得的脊椎背角標本固定在4%多聚甲醛中30 min。隨后,將樣本轉移到30%蔗糖中,在4℃下完全脫水。將組織切成20 μm厚的切片。在PBS中洗滌3次后,用免疫熒光封閉劑在20～25℃下封閉切片1 h,然后與Iba1、GFAP一抗孵育,在4℃下過夜。用PBS洗滌3次后,將切片與二抗在20～25℃下避光孵育1 h。通過使用熒光顯微鏡進行觀察。Image J計算Iba1、GFAP陽性細胞數。

1.9 Western blot檢測IL-10、β-EP蛋白表達 在收獲脊椎背角組織后,在RIPA蛋白質裂解緩沖液中裂解,使用二辛可寧酸(BCA)蛋白質測定法測定蛋白質濃度。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳在80 V下分離蛋白質30 min,在100 V下分離60min,然后在300 mA下轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在室溫下用5%脫脂乳封閉1 h后,將膜與以下一抗在4℃下孵育過夜：IL-10(1∶1 000)、β-EP(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶1 000),用TBST洗滌3次后,將膜與辣根過氧化物酶偶聯的二抗在室溫下孵育1 h。用增強化學發光(ECL)試劑顯色蛋白質條帶。通過ImageJ軟件對蛋白質條帶灰度進行量化。

2 結果

2.1 黃芪甲苷對機械刺激和熱刺激敏感性的影響 LDH組較Sham組PWT、TWL值顯著減少(P<0.05);與LDH組比較,黃芪甲苷組PWT、TWL值顯著增多(P<0.05),而AS10組趨勢相反(P<0.05);黃芪甲苷+ AS10組較黃芪甲苷組PWT、TWL值顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠PWT和TWL比較 n=10,

2.2 黃芪甲苷對大鼠炎性因子的影響 LDH組較Sham組IL-1β、TNF-α水平顯著升高(P<0.05);與LDH組比較,黃芪甲苷組IL-1β、TNF-α水平顯著降低(P<0.05),而AS10組顯著上升(P<0.05);黃芪甲苷+ AS10組較黃芪甲苷組IL-1β、TNF-α水平顯著增加(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠炎性因子水平比較 n=10,ng/mL,

2.3 黃芪甲苷對大鼠脊椎背角神經元凋亡的影響 與Sham組比較,LDH組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05);與LDH組比較,黃芪甲苷組細胞凋亡率顯著減少,而AS10組趨勢相反(P<0.05);黃芪甲苷+ AS10組較黃芪甲苷組細胞凋亡率顯著增多(P<0.05)。見圖1,表3。

圖1 大鼠脊椎背角神經元凋亡情況(TUNEL染色×200)

表3 黃芪甲苷對大鼠細胞凋亡率的影響n=10,%,

2.4 黃芪甲苷對大鼠脊椎背角Iba1、GFAP表達的影響 與Sham組比較,LDH組Iba1、GFAP陽性細胞數顯著升高(P<0.05);與LDH組比較,黃芪甲苷組Iba1、GFAP陽性細胞數顯著下降,而AS10組趨勢相反(P<0.05),黃芪甲苷+ AS10組較黃芪甲苷組Iba1、GFAP陽性細胞數顯著增加(P<0.05)。見表4,圖2。

圖2 脊椎背角Iba1、GFAP陽性細胞數(免疫熒光染色×200)

表4 黃芪甲苷對Iba1、GFAP陽性細胞數的影響 n=10,個,

2.5 黃芪甲苷對大鼠IL-10β/endorphin通路蛋白水平的影響 LDH組較Sham組IL-10、β-EP蛋白水平顯著下調(P<0.05);與LDH組比較,黃芪甲苷組IL-10、β-EP蛋白水平顯著升高(P<0.05),而AS10組顯著降低(P<0.05);黃芪甲苷+ AS10組較黃芪甲苷組IL-10、β-EP蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見圖3,表5。

圖3 5組大鼠IL-10、β-EP蛋白表達

表5 5組大鼠IL-10、β-EP蛋白水平比較n=10,

3 討論

LDH是臨床中最常見的背痛疾病,近年來,隨著社會的不斷發展以及工作和生活習慣的改變,LDH正在影響越來越多的年輕人[11]。LDH患病率多為30～50歲的成年人,男女比例為2∶1[12]。近年,人們發現中醫藥可以促進LDH的改善,有效緩解LDH癥狀[13]。黃芪甲苷是中藥黃芪的主要活性成分,黃芪甲苷可以通過抑制神經炎癥減輕坐骨神經慢性收縮損傷大鼠神經性疼痛[14]。Rao等[5]也發現,黃芪甲苷可以通過抑制脊髓損傷大鼠脊髓神經元的炎癥和凋亡起到神經保護作用。以上研究表明,黃芪甲苷可能在緩解神經痛方面起到治療效果。本研究通過移植髓核構建LDH大鼠模型,結果發現,LDH組PWT、TWL值顯著下降,而黃芪甲苷治療后PWT、TWL值顯著增加,提示黃芪甲苷可以改善機械和熱刺激敏感性,減輕神經痛。

研究表明,神經性疼痛的發生與炎癥因子的水平有關,脊髓炎癥促進了神經性疼痛的發生[15]。神經膠質細胞在神經炎癥和神經性疼痛的發展中起重要作用。星形膠質細胞和小膠質細胞通過釋放促炎細胞因子(IL-1β,TNF-α)參與病理性神經炎癥過程[16]。Iba1和GFAP分別是小膠質細胞和星形膠質細胞的主要標志物[17]。本研究發現,LDH組大鼠TNF-α、IL-1β水平、Iba1、GFAP陽性細胞數量均顯著升高,而黃芪甲苷組TNF-α、IL-1β水平、Iba1、GFAP陽性細胞數量均顯著降低,表明黃芪甲苷可能通過抑制促炎因子的釋放,抑制神經炎癥,改善LDH大鼠神經根損傷。在神經性疼痛的發展過程中觀察到脊髓細胞凋亡[18]。Deng等[19]發現神經損傷大鼠神經性疼痛的發展與脊髓細胞凋亡增加有關。本研究發現,LDH組細胞凋亡率顯著升高,而黃芪甲苷處理后,細胞凋亡率顯著下降,上述結果表明,黃芪甲苷可能通過抑制神經炎癥以及細胞凋亡來減輕LDH大鼠神經根損傷。

有研究報道,增加IL-10、β-EP蛋白水平可以改善神經損傷后小鼠的機械和熱超敏反應[20]。激活IL-10/β-EP通路還可以抑制小膠質細胞釋放炎性因子,進而緩解神經性疼痛[7]。本研究發現,IL-10、β-EP在 LDH大鼠脊椎背角組織低表達,表明LDH大鼠可能通過抑制IL-10/β-EP通路誘發神經痛的發生。而黃芪甲苷處理后IL-10、β-EP蛋白水平顯著增加,表明黃芪甲苷可能通過激活IL-10/β-EP通路抑制神經炎癥以及細胞凋亡從而改善LDH大鼠神經根損傷。為了進一步證實此猜想,我們給予LDH大鼠注射IL-10/β-EP信號通路抑制劑AS10,結果發現,AS10組與黃芪甲苷組結果相反,AS10減弱了黃芪甲苷對LDH大鼠神經根損傷的改善作用。

綜上所述,黃芪甲苷可能通過上調IL-10/β-EP通路,減輕LDH大鼠炎性反應和細胞凋亡,緩解神經根損傷。