冷應(yīng)激反應(yīng)加重大鼠多囊卵巢綜合征生殖功能障礙

高雪 康媛 滕月

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)發(fā)病率為4%～10%,主要特征為月經(jīng)滯后、月經(jīng)過多和崩漏等[1-2]。PCOS發(fā)病機(jī)制與信號(hào)通路的異常有關(guān)。熱休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)在機(jī)體受到應(yīng)激后迅速增加,參與蛋白運(yùn)輸,保護(hù)細(xì)胞免受刺激[3],同時(shí)還參與細(xì)胞的凋亡及抗氧化等作用,在抵抗冷應(yīng)激早期反應(yīng)時(shí),HSP90是由應(yīng)激細(xì)胞分泌[4],HSP90還是促炎因子,其可通過調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路的細(xì)胞因子,從而調(diào)控炎性反應(yīng)水平并影響細(xì)胞凋亡[5]。炎性反應(yīng)參與PCOS的全過程[6]。己證實(shí)PCOS的主要病理為皮質(zhì)纖維化及卵巢間質(zhì)增生等,均是慢性炎性反應(yīng)體現(xiàn)[7]。當(dāng)機(jī)體受到冷應(yīng)激刺激時(shí),核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)表達(dá)增加,同時(shí)胰島素抵抗水平增加,雄激素水平升高,促進(jìn)PCOS的產(chǎn)生及發(fā)展。但目前關(guān)于冷應(yīng)激對(duì)于PCOS大鼠的報(bào)道較少,本實(shí)驗(yàn)研究冷應(yīng)激反應(yīng)對(duì)PCOS大鼠生殖功能的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只SPF級(jí)SD雌性大鼠體質(zhì)量200～300 g[上海凱學(xué)生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)-2020-0126)],適應(yīng)飼養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)已通過我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批號(hào)：20200120。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 蘇木素-伊紅染色液(上海源葉生物科技公司),FSH、LH、T、SOD、MDA和GSHPx試劑盒(均上海仁捷生物科技公司),TUNEL工作液(杭州浩克生物科技公司),HSP90、NF-κB p65、IkB、TAK-1和RIP一抗(均武漢艾美捷生物科技公司),辣根過氧化物酶二抗(河北翰林生物科技公司)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠的分組與處理：于50只大鼠中隨機(jī)抽取10只作為對(duì)照組,剩余40只大鼠根據(jù)文獻(xiàn)[8]建立PCOS模型。40只大鼠建模成功,隨機(jī)分為模型組、冷應(yīng)激組、抑制劑組、聯(lián)合組,每組10只。冷應(yīng)激組刺激溫度為4℃,刺激時(shí)間為 3 h (11∶00～14∶00),干預(yù)3周;抑制劑組大鼠于腹腔注射格爾德霉素(50 mg/kg,HSP90抑制劑),持續(xù)5 d;聯(lián)合組大鼠在冷應(yīng)激組的前提下給予HSP90抑制劑干預(yù)。

1.3.2 ELISA檢測(cè)血清性激素水平及氧化應(yīng)激水平：取5組大鼠頸動(dòng)脈血2 mL,1 250 r/min,離心5 min,后取血清。ELISA檢測(cè)促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、黃體生成素(luteinising hormone,LH)、睪酮(testosterone,T)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSHPx),嚴(yán)格按照說明書操作。

1.3.3 HE染色觀察卵巢組織病理形態(tài)：按常規(guī)操作,光鏡下觀察組織形態(tài)。

1.3.4 TUNEL染色檢測(cè)卵巢組織細(xì)胞凋亡：按上述方法取組織并脫水后,放于載玻片上,加入蛋白酶K工作液孵育20 min后清洗,加入TUNEL工作液反應(yīng)1 h后清洗,滴加50 μL convertr-POD,反應(yīng)0.5 h后清洗,DAB顯色液顯色,光鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.3.5 免疫印跡檢測(cè)卵巢組織HSP90、NF-κB p65、核轉(zhuǎn)錄因子抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor kappa-B,IKB)、轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1(relationship between transforming growth factor β kinase 1,TAK-1)、受體相互作用蛋白(receptor interacting protein,RIP)蛋白表達(dá)：取卵巢組織剪碎后,3 000 r/min,離心5 min,離心半徑為12 cm,取上清液,測(cè)蛋白濃度。蛋白變性后進(jìn)行電泳,電泳后的蛋白溶液置于PVDF膜上,脫脂奶粉封閉,2 h后將PVDF取出,加入NF-κB p65、IkB、TAK-1、RIP、HSP90一抗(1∶500)4℃過夜孵育過夜,取出PVDF膜,加辣根過氧化物酶二抗(1∶500),孵育2 h進(jìn)行清洗、顯色、拍照并分析條帶吸光度值absorbance,計(jì)算各指標(biāo)相對(duì)水平。

2 結(jié)果

2.1 冷應(yīng)激對(duì)PCOS大鼠性激素水平的影響 與對(duì)照組比較,模型組FSH降低、LH與T升高(P<0.05),與模型組比較,冷應(yīng)激組和抑制劑組FSH降低、LHT升高(P<0.05),與抑制劑組比較,冷應(yīng)激組FSH降低、LH與T升高(P<0.05)。見表1。

表1 冷應(yīng)激對(duì)PCOS大鼠性激素水平的影響 n=10,

2.2 冷應(yīng)激對(duì)PCOS大鼠氧化應(yīng)激水平的影響 與對(duì)照組比較,模型組SOD和GSH-Px水平降低,MDA水平升高(P<0.05),與模型組比較，冷應(yīng)激組與抑制劑組SOD和GSH-Px水平升高,MDA水平降低(P<0.05),與抑制劑組比較,冷應(yīng)激組SOD和GSH-Px水平降低,MDA水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 冷應(yīng)激對(duì)PCOS大鼠氧化應(yīng)激水平的影響 n=10,

2.3 冷應(yīng)激對(duì)PCOS大鼠卵巢形態(tài)的影響 對(duì)照組大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)正常;模型組與聯(lián)合組卵巢皮質(zhì)黃體及卵泡減少,卵泡囊性擴(kuò)張并有閉鎖產(chǎn)生;冷應(yīng)激組與抑制劑組大鼠的卵巢主要表現(xiàn)為大量的小竇卵泡、囊性卵泡和增大的卵泡膜細(xì)胞層,且以冷應(yīng)激組更為嚴(yán)重。見圖1。

圖1 冷應(yīng)激對(duì)PCOS大鼠卵巢病理形態(tài)(HE×100)

2.4 冷應(yīng)激對(duì)PCOS大鼠卵巢組織細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組、模型組、抑制劑組、冷應(yīng)激組與聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率分別為(5.62±0.58)%、(41.38±3.92)%、(52.67±4.22)%、(63.48±5.71)%和(40.62±4.28)%,對(duì)照組卵巢組織中細(xì)胞凋亡率低于模型組、聯(lián)合組(F=168.200,P<0.001),抑制劑組卵巢組織中細(xì)胞凋亡率較模型組高(P<0.001),冷應(yīng)激組細(xì)胞凋亡率較抑制劑組高(P<0.001)。見圖2。

圖2 冷應(yīng)激對(duì)PCOS大鼠卵巢組織細(xì)胞凋亡的影響(TUNEL×200)

2.5 冷應(yīng)激對(duì)5組PCOS大鼠HSP90、NF-κB p65、IkB、TAK-1、RIP蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,模型組大鼠卵巢組織中HSP90、NF-κB p65、IkB、TAK-1、RIP升高(P<0.05),與模型組比較,冷應(yīng)激組與對(duì)照組大鼠卵巢組織中HSP90、NF-κB p65、IkB、TAK-1、RIP升高(P<0.05)。見表3,圖3。

圖3 5組大鼠HSP90、NF-κB p65、IkB、TAK-1和RIP水平比較

表3 5組大鼠HSP90、NF-κB p65、IkB、TAK-1、RIP水平比較 n=10,

2.6 HSP90與NF-κB p65在冷應(yīng)激刺激后的相關(guān)性分析 大鼠卵巢組織中HSP90與PI3K在冷應(yīng)激刺激后的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.581,P<0.001)。見圖4。

圖4 HSP90與NF-κB p65相關(guān)分析

3 討論

HSP90 是應(yīng)激反應(yīng)上調(diào)的分子伴侶蛋白,過度激活的HSP90參與PCOS的產(chǎn)生及發(fā)展。此外HSP90還是促炎因子的一種。HSP90靶蛋白R(shí)IP激酶、TAK-1激酶和IκB 激酶均屬于NF-κB通路相關(guān)因子,當(dāng)細(xì)胞受到刺激后,IKB磷酸化后將NF-κB釋放至胞核并發(fā)生磷酸化,通過調(diào)控下游相關(guān)因子,促進(jìn)炎性反應(yīng)發(fā)展[9]。HSP90在PCOS大鼠中顯著降低,抑制其水平后會(huì)加重PCOS發(fā)展[10]。但HSP90在經(jīng)過冷應(yīng)激刺激后表達(dá)會(huì)升高,因此本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用HSP90抑制劑作為對(duì)照,進(jìn)一步證實(shí)冷應(yīng)激可加重PCOS大鼠病情。在本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過冷應(yīng)激刺激后NF-κB p65、IkB、TAK-1、RIP、HSP90水平升高,且HSP90與NF-κB在冷應(yīng)激刺激下具有正相關(guān)關(guān)系。提示冷應(yīng)激可能是通過抑制HSP90表達(dá)加重炎性反應(yīng),從而加重PCOS大鼠病情。二甲雙胍通過抑制HSP水平抑制NF-κB通路,減少炎性反應(yīng),改善PCOS病情[11]。證實(shí)了本研究上述結(jié)論。此外,NF-κB信號(hào)通路還可調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為。本研究發(fā)現(xiàn)PCOS大鼠卵巢組織細(xì)胞在經(jīng)過冷應(yīng)激干預(yù)后會(huì)加速凋亡。研究提出,通過抑制NF-κB 信號(hào)通路,減少卵巢顆粒細(xì)胞凋亡,改善PCOS病情[12]。證實(shí)了本研究的上述結(jié)論。基于此,本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為冷應(yīng)激干預(yù)后導(dǎo)致HSP90異常升高從而激活了NF-κB通路后,加重了炎性反應(yīng)及卵巢組織細(xì)胞凋亡,從而促進(jìn)PCOS惡化。

PCOS病理特點(diǎn)之一是高雄激素、高促黃體生成素,同時(shí)也是導(dǎo)致生殖功能產(chǎn)生障礙的重要原因[13]。研究認(rèn)為應(yīng)激狀態(tài)可能通過激活卵巢HSP90的表達(dá),降低FSH水平,阻礙顆粒細(xì)胞增殖分化,從而降低芳香化酶活性,使雌激素減少,卵泡發(fā)育受阻,促進(jìn)大鼠形成多囊卵巢狀態(tài)[14]。常壯鵬等[15]研究提示,通過抑制NF-κB炎性反應(yīng)信號(hào)通路,可改善卵巢組織病理形態(tài),并調(diào)節(jié)卵巢激素微環(huán)境。本研究與上述結(jié)論相似。這提示冷應(yīng)激通過增加HSP90反應(yīng)介導(dǎo)NF-κB通路,進(jìn)而調(diào)控性激素水平,加重PCOS生殖功能障礙。此外,本研究HE染色及氧化應(yīng)激結(jié)果也可證實(shí)上述結(jié)論。

綜上所述,冷應(yīng)激可通過增加HSP90水平后,促進(jìn)NF-κB通路激活,從而加重PCOS生殖功能障礙。