miR-429對燒傷小鼠肺組織炎性反應和氧化應激的影響

張珂珂 黃國寶

嚴重燒傷是一個復雜的病理生理過程,可導致多種器官功能障礙[1-3]。美國的一項流行病學調查表明,在全身面積>30%的嚴重燒傷患者中,急性肺損傷(ALI)是最常見的并發癥,其發病率為26.7%～45%,死亡率為40%～60%[4-5]。ALI通常發生在燒傷后24～48 h內,主要表現為肺泡-毛細血管屏障受損、組織水腫、炎性細胞浸潤和氧化應激損傷[6-7]。其中,炎癥反應和氧化應激在ALI中扮演了重要的角色[8]。研究證明,miRNA作為炎性反應和氧化應激相關基因的關鍵調節因子,被認為是改善ALI的潛在治療靶點[9]。例如,miR-135a-5p通過靶向TBK1進而調控ALI相關的炎性反應和氧化應激反應[10]。研究證明, miRNA-429降低與肺組織損傷密切相關,抑制miRNA-429表達能夠明顯降低炎性細胞因子的分泌,對肺損傷具有一定的保護作用[11]。另外,Fan等[12]證實,過表達miRNA-429能夠提高氧化應激相關分子SOD和CAT含量。以上結果顯示,miRNA-429在炎性反應、氧化應激等方面發揮重要作用。本研究旨在明確miR-429在燒傷模型小鼠中的表達情況,并進一步探討miR-429對燒傷小鼠ALI的影響及分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只6～8周齡C57BL/6小鼠均購買于上海南方模式生物科技有限公司,許可證號為KYXK(滬)2023-0005,體重為200～250 g,購入后于SPF級動物飼養中心飼養,飼養濕度約55%～60%,溫度23～25℃,12 h晝夜光照循環,正常進食和自由飲水。待C57BL/6小鼠適應性飼養1周后再進行實驗。實驗均遵循動物實驗指導原則。該實驗經過濰坊醫學院附屬醫院動物倫理與福利委員會批準。

1.2 主要試劑 MDA檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒、CAT檢測試劑盒、 GSH檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司;TNF-α ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒以及IL-8 ELISA試劑盒均購自武漢艾美捷科技有限公司;EASYspin Plus 快速RNA提取試劑盒購自杭州昊鑫生物公司;Hifair?Ⅲ One Step RT-qPCR SYBR Green試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司;蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒、RIPI組織裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、TUNEL試劑盒均購自北京索萊寶生物技術有限公司;Nrf2抗體、HO-1抗體、GAPDH抗體以及HRP標記的二抗均購自美國Abcam公司;miR-429 antagomir及其陰性對照由廣州銳博生物技術有限公司提供。熒光定量PCR儀購自美國Roche公司;低溫高速離心機、化學發光酶標儀均購自美國Thermo Fisher公司;熒光顯微鏡觀察購自日本奧林普斯公司。

1.3 方法

1.3.1 構建小鼠燒傷模型：根據楊星等[13]報道,采用熱水燙傷法構建小鼠燒傷模型。用30 mg/kg的戊巴比妥鈉對小鼠進行腹膜內麻醉,將小鼠背部毛發剃除后,然后將其固定在自制的模板裝置上。隨后將熱水(100℃)倒在小鼠皮膚的背表面上10 s造成深Ⅱ度燒傷創面。其中,全層皮膚燒傷平均占全身表面積的30%。

1.3.2 動物分組與處理：24只C57BL/6小鼠隨機數表法分為對照組、模型組、陰性對照組和miR-429 抑制劑組,每組6只。其中,模型組、陰性對照組和miR-429 抑制劑組小鼠通過熱水燙傷法構建小鼠燒傷模型。另外,根據殷佳娜等[14]的給藥方式,在術前3 d,miR-429 抑制劑組和陰性對照組按20 μg/只的劑量分別通過尾靜脈注射miR-429 antagomir慢病毒和陰性對照miR-NC,1次/d,持續3 d;對照組和模型組小鼠給予等體積0.9%氯化鈉溶液。實驗動物于造模成功12 h后處死,取右肺下葉組織,以備待用。

1.3.3 qRT-PCR實驗檢測小鼠肺組織中miR-429表達 根據Trizol裂解液說明書,提取肺組織中的總RNA。采用紫外吸收法測定RNA的純度和濃度,使用EASYspin Plus 快速RNA提取試劑盒按照說明書反轉錄生成cDNA。隨后,按照Hifair?III one step RT-qPCR SYBR green 試劑盒說明書進行RT-qPCR反應。其中以miR-429 (正向：5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTA

TT-3’,反向： 5’-CGCGCGTAATACTGTCTGGTAA-3’)和U6 (正向： 5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’,反向： 5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’)為引物,擴增miR-429。RT-qPCR反應條件如下：逆轉錄：預變性：95℃,5 min;擴增：95℃,10 s;60℃,30 s,共40個循環。最后采用2-ΔΔCt法計算miR-429的相對表達量。

1.3.4 ELISA法檢測小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA、SOD、CAT和GSH表達：收集各組小鼠100 mg肺組織,按照試劑盒說明書測定各組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA、SOD、CAT和GSH含量。

1.3.5 HE染色觀察小鼠肺損傷情況：將肺組織切割成3 mm3大小的組織塊,用4%的多聚甲醛固定組織樣本48 h后,石蠟包埋,切片(厚度為5 μm)。隨后,將切片浸入到二甲苯和乙醇中。待切片脫水后,用蘇木精和伊紅染色液染色,樹膠封片。最后使用光學顯微鏡觀察肺組織病理結構變化。其中,細胞核呈藍色,而細胞漿呈粉紅色或紅色。

1.3.6 TUNEL法檢測小鼠肺組織細胞凋亡情況：將制備的石蠟切片經梯度乙醇水合后,用無DNase的蛋白酶K孵育10 min。3% H2O2溶液中室溫孵育20 min,然后與TUNEL反應液在37℃孵育1 h。最后,用PBS清洗切片并通過熒光顯微鏡觀察TUNEL陽性細胞。使用Image J軟件對TUNEL陽性細胞進行計數。

1.3.7 Western blotting檢測Nrf2和HO-1蛋白表達：用RIPA組織裂解液(含1% PMSF)于冰上充分裂解肺組織,用4℃預冷的離心機以12 000 r/min離心20 min,取上清并使用BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。隨后,加入5×loading buffer,100℃煮沸10 min,使蛋白變性。將等量總蛋白用10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離,隨后將凝膠轉移至經活化的PVDF膜上進行電轉。轉膜結束后,3%的BSA溶液室溫封閉1 h。然后將蛋白膜與一抗4℃孵育過夜。其中一抗的稀釋比均為1∶1 000。TBST清洗后用HRP標記的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。PBS洗滌3次后,使用ECL顯影液曝光蛋白,Image J軟件分析條帶,檢測各組小鼠肺組織中Nrf2、HO-1和GAPDH蛋白表達。

2 結果

2.1 4組小鼠肺組織中miR-429表達比較 與對照組比較,miR-429在模型組小鼠肺組織中高表達(P< 0.05);與模型組比較,miR-429在陰性對照組中的表達差異無統計學意義(P>0.05);與陰性對照組比較,miR-429在抑制劑組中的表達明顯下降(P< 0.05)。見表1。

表1 4組小鼠肺組織中miR-429和炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達比較 n=6,

2.2 4組小鼠肺組織中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達比較 與對照組相比,模型組小鼠肺組織中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達均顯著升高 (均P< 0.05)。與模型組相比,陰性對照組小鼠肺組織中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達均無明顯差異(均P> 0.05)。與陰性對照組比較,miR-429抑制劑組小鼠肺組織中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達均顯著降低 (P< 0.05)。見表1。

2.3 4組小鼠肺組織中MDA、SOD、CAT和GSH含量比較 與對照組比較,模型組小鼠肺組織中MDA含量顯著升高,而SOD、CAT和GSH含量均明顯下降(P<0.05)。與模型組相比,陰性對照組小鼠肺組織中MDA、SOD、CAT和GSH含量均無明顯差異(P>0.05)。與陰性對照組比較,miR-429抑制劑組小鼠肺組織中MDA含量顯著降低,而SOD、CAT和GSH含量均明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 4組小鼠肺組織中MDA、SOD、CAT和GSH表達比較 n=6,nmol/mg,

2.4 4組小鼠肺組織病理學變化比較 在對照組中,小鼠肺組織結構清晰,無炎癥細胞浸潤。與對照組比較,模型組小鼠的肺泡壁變寬,出現水腫和明顯的炎癥細胞浸潤。與陰性對照組比較,模型組小鼠肺組織的病理結構無明顯變化。與陰性對照組比較,miR-429抑制劑組小鼠肺組織中的炎癥和水腫情況得到明顯緩解,且肺泡壁變窄。見圖1。

圖1 4組小鼠肺組織HE染色(HE×100)

2.5 4組小鼠肺組織細胞凋亡情況比較 與對照組比較,模型組小鼠肺組織中TUNEL陽性細胞數顯著升高 (P< 0.05)。與模型組比較,陰性對照組小鼠肺組織中TUNEL陽性細胞數無明顯差異(P> 0.05)。與陰性對照組比較,miR-429抑制劑組小鼠肺組織中TUNEL陽性細胞數顯著降低(P< 0.05)。見圖2,表3。

圖2 4組小鼠肺組織中TUNEL陽性細胞數比較;綠色為TUNEL陽性細胞,藍色細胞核;標尺=40 μm

表3 4組小鼠肺組織中TUNEL陽性細胞數以及Nrf2和HO-1蛋白表達比較n=6,

2.6 4組小鼠肺組織中Nrf2和HO-1蛋白表達 與對照組相比,模型組小鼠肺組織中Nrf2和HO-1蛋白表達顯著降低 (P< 0.05)。與模型組相比,陰性對照組小鼠肺組織中Nrf2和HO-1蛋白表達無明顯差異(P> 0.05)。與陰性對照組比較,miR-429抑制劑組小鼠肺組織中Nrf2和HO-1蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖3,表3。

圖3 4組小鼠肺組織中Nrf2和HO-1蛋白表達表達

3 討論

ALI是一種常見的呼吸系統疾病,其癥狀包括肺微血管通透性增加,以及炎癥細胞浸潤引起的彌漫性肺間質和肺泡腔水腫。ALI是大面積深度燒傷患者最常見的并發癥,特別是在合并吸入性損傷、休克和延遲復蘇時[15]。因此,如何防治ALI對燒傷患者的治療具有重要的臨床意義。

文獻顯示,miR-429在脂多糖(LPS)誘導的小鼠ALI模型和LPS刺激的細胞損傷模型中表達上調,而抑制miR-429表達可改善LPS小鼠的肺損傷[16-17]。與上述研究一致,我們在燒傷誘導的ALI小鼠的肺組織中觀察到高表達的miR-429。提示miR-429或許對燒傷誘導的ALI發揮重要的調節功能,抑制miR-429表達能夠減輕燒傷小鼠肺組織損傷。因此,為了驗證這一假設,我們利用慢病毒載體miR-429 antagomir通過尾靜脈注射的方式降低小鼠體內miR-429表達。本結果顯示,燒傷小鼠給予miR-429 antagomir干預后,其肺組織中miR-429 表達顯著下調。燒傷后,微血管通透性的升高會導致液體滲漏和微循環灌注異常,進而引起炎癥級聯反應。炎性介質升高會引誘內皮細胞產生過量的ROS,從而導致內皮細胞損傷。受損的內皮細胞反過來增加血管通透性,促進炎性細胞浸潤,從而惡化并引發額外的肺損傷[18]。因此,炎性反應和氧化應激在燒傷誘導的ALI中起著核心作用。本研究中,燒傷小鼠肺組織中促炎細胞因子TNF-α、IL-1 β和IL-6水平明顯升高,TUNEL陽性細胞數量增加。同時,氧化應激相關分子發生明顯改變,即MDA含量明顯升高,而SOD、CAT和GSH酶活力顯著降低。然而,當燒傷小鼠下調miR-429表達后能夠逆轉上述結果。提示miR-429對燒傷小鼠的肺損傷具有一定的保護作用。miR-429對燒傷小鼠肺組織的保護作用也在肺相關的病理學觀察中得到進一步驗證。HE染色顯示,燒傷小鼠肺泡壁變寬,出現水腫和明顯的炎癥細胞浸潤,而抑制miR-429表達后肺組織病變明顯減輕。總之,抑制miR-429表達能夠減少燒傷誘導的ALI中促炎細胞因子的產生、抑制細胞凋亡和降低氧化應激反應。

NRF2/HO-1信號參與抗氧化和抗炎過程,能夠減少線粒體損傷,調節鈣離子內流和細胞死亡,在多種疾病的進程中發揮了重要作用,如肺部疾病、心血管疾病和神經疾病等[19]。先前的研究表明,Nrf2/HO-1軸通過下調炎性因子,降低MDA含量,提高SOD和GSH-Px水平,參與了白藜蘆醇誘導的心肌缺血再灌注損傷小鼠的炎癥和氧化應激[20]。上述研究表明,Nrf2/HO-1軸具有抗炎和抗氧化活性。在本研究中,我們發現在燒傷小鼠肺組織中Nrf2/HO-1信號通路被明顯激活,而降低miR-429表達能夠明顯抑制Nrf2/HO-1信號通路的活性。提示miR-429對燒傷小鼠肺組織的保護作用可能與Nrf2/HO-1信號通路密切相關。因此,在接下來的實驗中我們將通過Nrf2/HO-1信號通路抑制劑Nrf2/HO-1-IN-1,來進一步驗證miR-429對Nrf2/HO-1通路的調控作用。

綜上所述,miR-429低表達能夠明顯提高燒傷小鼠肺組織SOD、CAT和GSH活性并降低 MDA 含量,降低 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平,同時提高 Nrf2、HO-1蛋白表達量,提示抑制miR-429表達具有抑制燒傷小鼠肺組織炎性反應和氧化應激的作用,其機制可能與激活 Nrf2/HO-1 通路有關。