miR-141-3p靶向MYT1L促進結腸癌細胞的惡性進展

肖楊斌 方鎧寧

1 湖南省岳陽市人民醫院胃腸外科 414000; 2 岳陽市婦幼保健院婦科

結腸癌(Colon cancer,CC)是臨床上常見的消化道惡性腫瘤,在全球的發病率一直很高,每年導致大量死亡,排在惡性腫瘤和致死病因的第四位,已成為嚴重威脅人類身體健康的惡性腫瘤之一[1]。盡管已經開發了綜合治療方案,但結腸癌的預后仍不理想,這可能歸因于缺乏早期診斷和有效的靶向藥物[2]。miRNA是短的非編碼RNA分子,由20～24個核苷酸組成,其主要通過完全或不完全結合靶基因的3’-UTR來調節基因表達[3]。近年來的研究表明,部分miRNA可能是結腸癌的候選預后和診斷生物標志物[4]。研究表明miR-141-3p對肺腺癌[5]、鼻咽癌[6]細胞的遷移、增殖、凋亡活動等都存在調控作用。MYT1L是一小組緊密相關的鋅指轉錄因子家族的成員,先前有研究表明,miR-338-3p可通過靶向MYT1L而抑制膠質瘤細胞增殖[7]。目前對miR-141-3p和MYT1L在結腸癌中的機制研究較少。本研究以結腸癌細胞為體外研究對象,探討miR-141-3p靶向調控MYT1L對結腸癌細胞的惡性進展的影響,從而探究miR-141-3p和MYT1L在結腸癌中的調控機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器 正常人結腸上皮細胞CCD841CON、人結腸癌細胞系HCT8、SW480和HCT116購自中國北納生物。胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)購自美國Invitrogen公司;青霉素和鏈霉素、DMEM培養基、MEM培養基、Lipofectamine2000試劑購自美國Gibco公司;Trizol、結晶紫購自美國Thermo Fisher Scientific公司;qScript cDNA合成試劑盒購自美國Quantabio公司;miScript SYBR Green PCR試劑盒購自德國Qiagen公司;所有引物均購自上海生工生物工程有限公司;CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司;Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自美國Biovision公司;phRL-SV40對照載體購自美國Promega公司;24孔Transwell室購自美國Corning公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液購自中國索萊寶公司;MyT1L兔多克隆抗體、GAPDH兔單克隆抗體、山羊抗兔IgG H&L(HRP)購自英國Abcam公司、NC膜購自美國Millipore公司;ECL試劑盒購自中國碧云天公司;流式細胞儀購自國BD Biosciences公司。

1.2 生物信息學方法 從TCGA數據庫下載TCGA-COAD的mRNA、miRNA表達量數據,利用edgeR進行差異分析(|logFC|>2,Padj<0.05)。并對差異miRNA進行生存分析,確定研究的目標miRNA。利用TargetScan、miRDB兩個數據庫對目標miRNA進行靶向預測,并與差異mRNA取交集,獲得與目標miRNA具有靶向結合位點的差異mRNA。

1.3 細胞培養 人結腸癌細胞系HCT8、SW480和HCT116在含有10%FBS,100μg/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM培養基中培養。正常人結腸上皮細胞CCD841CON在含有10%FBS的MEM培養基中培養。所有細胞均在37℃的含5%CO2的培養箱中培養。

1.4 細胞轉染及載體質粒構建 細胞按1.2×106/孔接種至6孔板中,待生長至對數期時,將NC mimic和miR-141-3p mimic分別經Lipofectamine2000試劑瞬時轉染到各組結腸癌細胞中,并在含有5% CO2、37℃的培養基中培養,6h后更換培養基繼續培養48h進行后續實驗。利用慢病毒包裝構建MYT1L的表達載體。合成帶有KpnI和XhoI限制性酶切位點的MYT1L cDNA(pUC-MYT1L)和其對照序列pUC-NC序列(序列由BLOCK-iTTMRNAi Deshgner網站設計),使用T4連接酶將其連接到慢病毒表達載體pLVX-IRES-neo 上并轉染受體細胞。

1.5 qRT-PCR檢測 用Trizol從細胞中提取總RNA。使用qScript cDNA合成試劑盒將1μg的miR-141-3p和MYT1L總RNA分別用于合成cDNA,使用miScript SYBR Green PCR試劑盒進行定量PCR。內參物為U6和GAPDH。PCR條件為:95℃ 2min,接著95℃ 5s和60℃ 30s循環40次。結果用2-ΔΔCt值來比較對照組和實驗組的目的基因miRNA相對表達量的差異,實驗重復3次。qRT-PCR引物見表1。

表1 qRT-PCR引物列表

1.6 CCK-8檢測細胞增殖 用CCK-8試劑盒進行細胞增殖測定。將結腸癌細胞系HCT8的細胞以6×105個細胞/孔的密度接種在24孔板中,每孔500μl。細胞在37℃、5%CO2環境下培養。在培養0h、24h、48h和72h時,向每孔加入50μl CCK-8溶液,繼續培養4h后,檢測450nm處OD值。

1.7 通過流式細胞術評估HCT8細胞的凋亡率 在6孔板中以2×104個細胞/孔的濃度培養HCT8細胞,并用pUC-MYT1L轉染。培養48h后,將細胞用胰蛋白酶(不含EDTA)消化,然后收集并重懸于PBS(4℃)中。在4 ℃條件下以1 000r/min的轉速離心細胞并去除PBS后,加入結合緩沖液(1×)重懸細胞,然后,加入膜聯蛋白V-FITC凋亡試劑盒中的膜聯蛋白V-FITC(Biovision,K101)和PI避光染色15min。流式細胞儀(BD Biosciences)用于檢測細胞凋亡率。

1.8 雙熒光素酶檢測miR-141-3p和MYT1L的靶向性 將HCT8細胞以6×105個細胞/孔接種在24孔板中并孵育24h。隨后,用0.8μg pGL3-MYT1L-3’UTR和pGL3-MYT1L-3’UTR Mut質粒,用phRL-SV40對照載體共轉染細胞,然后使用Lipofectamine 2000試劑盒將miR-141-3p mimic及其陰性對照分別轉染到細胞中。在轉染后24h使用雙熒光素酶測定法檢測海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶活性,實驗重復3次。

1.9 Transwell檢測細胞遷移 將大約2×104個細胞加入24孔Transwell小室上室中。將含有10%FBS的DMEM培養基填充到下室中。在37 ℃溫育24h后,棄去培養基,PBS洗滌小室3次,用棉簽涂敷器除去未通過膜的細胞,隨后用4%多聚甲醛固定,并對膜下表面的細胞進行結晶紫染色,顯微鏡下觀察并拍照。

1.10 Western blot檢測MYT1L蛋白表達量 細胞轉染48h后,將各組細胞使用冷PBS洗滌3次,隨后加入RIPA裂解液,置于冰上裂解10min。采用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量,隨后加入10μl上樣緩沖液于95℃煮10min后,于100V條件進行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結束后,在100mA條件下,將蛋白轉移(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)至NC膜,封閉液(5% BSA/TBST)封閉60min,加入一抗,4℃過夜孵育,內參為GAPDH。一抗:MYT1L(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)。一抗孵育完畢后,用1×TBST溶液洗膜3次,每次5min,加辣根過氧化酶標記的二抗:山羊抗兔IgG H&L(HRP)(1∶10 000),室溫下孵育120min,1×TBST洗膜3次,每次20min。用ECL試劑盒對蛋白樣品進行顯影,觀察蛋白印記,并進行圖像分析。用Quantity One軟件分析條帶灰度值,檢測MYT1L的相對表達量,用目的條帶與內參條帶灰度值之比來表示。實驗重復3次。

1.11 統計學方法 所有數據均采用SPSS22.0統計學軟件進行處理,計量資料采用均值±標準差的形式表示,兩組間比較為t檢驗,多組間的比較應采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-141-3p在結腸癌中的表達情況 edgeR差異分析結果顯示,一共獲取299個差異miRNA和2 065個差異mRNA (見圖1a)。其中,結腸癌組織中的miR-141-3p的表達水平顯著高于正常組織(P<0.05,見圖1b)。生存分析結果顯示,結腸癌組織中miR-141-3p高表達患者的總生存時間顯著低于低表達患者(見圖1c)。qRT-PCR檢測人結腸癌細胞HCT8、SW480和HCT116和正常人結腸上皮細胞CCD841CoN中 miR-141-3p的表達量。結果表明,miR-141-3p在人不同結腸癌細胞中表達均顯著高于人正常細胞(見圖1d)。選擇相對表達較高的HCT8細胞進行后續實驗。

圖1 miR-141-3p在結腸癌中表達量高

2.2 miR-141-3p高表達對細胞表型的影響 CCK-8檢測結果顯示,miR-141-3p mimic組的細胞增殖能力顯著高于NC mimic組(P<0.05,見圖2a)。Transwell實驗結果顯示,miR-141-3p mimic組的細胞遷移能力顯著高于NC mimic組(P<0.05,見圖2b)。miR-141-3p mimic組的細胞凋亡率顯著低于NC mimic組(P<0.05,見圖2c)。綜上,miR-141-3p的高表達會促進細胞的惡性表型。

圖2 過表達miR-141-3p導致HCT8細胞表型惡化

2.3 miR-141-3p與MYT1L在結腸癌細胞中的關系 利用TargetScan、miRDB兩個數據庫對miR-141-3p進行靶基因預測,并與下調的903個差異mRNA取交集,獲得38個與miR-141-3p具有靶向結合位點的靶基因 (見圖3a)。其中,miR-141-3p與MYT1L具有顯著的負相關性(見圖3b)。MYT1L在結腸癌組織中呈現極顯著的低表達(圖3c)。在HCT8細胞系中用qRT-PCR和Western blot檢測轉染NC mimic和miR-141-3p mimic后,MYT1L的mRNA和蛋白表達水平。結果表明,與NC mimic組相比,miR-141-3p mimic組的MYT1L的mRNA和蛋白表達水平均顯著下調(P<0.05,見圖3d～e)。隨后,利用雙熒光素酶驗證靶向關系。與MYT1L-W+NC mimic共轉染組相比,MYT1L-W+miR-141-3p mimic共轉染組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),而MYT1L-M+miR-141-3p mimic共轉染組的熒光素酶活性與MYT1L-M+NC mimic共轉染組無顯著差異(P>0.05,見圖3f),表明miR-141-3p可能與MYT1L的3’UTR結合。綜合上述結果可知miR-141-3p與MYT1L之間存在靶向調節關系。

圖3 miR-141-3p靶向下調MYT1L的表達

2.4 miR-141-3p與MYT1L共同作用對結腸癌細胞表型的影響 將HCT8細胞分組為:pUC-NC+NC mimic組、pUC-MYT1L+NC mimic組、pUC-MYT1L+miR-141-3p mimic組。CCK-8實驗結果顯示,pUC-MYT1L+NC mimic組細胞活性顯著低于pUC-NC+NC mimic組(均P<0.05),而pUC-MYT1L+miR-141-3p mimic組細胞活性顯著高于pUC-MYT1L+NC mimic組(均P<0.05,見圖4a)。Transwell實驗結果顯示,pUC-MYT1L+NC mimic組細胞遷移能力顯著低于pUC-NC+NC mimic組(P<0.05),而pUC-MYT1L+miR-141-3p mimic組細胞遷移能力顯著高于pUC-MYT1L+NC mimic組(P<0.05,見圖4b)。細胞凋亡實驗結果顯示,pUC-MYT1L+NC mimic組細胞凋亡率顯著高于pUC-NC+NC mimic組(P<0.05),而pUC-MYT1L+miR-141-3p mimic組細胞凋亡率顯著低于pUC-MYT1L+NC mimic組(P<0.05,見圖4c)。

圖4 在HCT8細胞系中miR-141-3p的上調,通過MYT1L使細胞表型惡化

3 討論

越來越多的證據表明,miRNA在腫瘤發生發展過程中發揮關鍵作用。在癌癥中發現了異常的miRNA表達,因此,這些miRNA可能被用來預測預后。miR-141-3p參與了不同組織來源的惡性腫瘤的發生和進展。例如miR-141-3p通過靶向Keap1-Nrf2通路促進卵巢癌的增殖、遷移等惡性生物學行為[8]。miR-141-3p通過ALKBH5介導的PRMT6的m6A修飾促進前列腺癌的惡性進展[9]。在本研究中,我們通過生物信息學方法發現miR-141-3p在結腸癌組織中高表達,并通過qRT-PCR在細胞系中進行驗證,檢測發現人結腸癌細胞系中miR-141-3p的表達量顯著高于正常人結腸上皮細胞系。結合已有的研究報道,我們猜測miR-141-3p在結腸癌中可作為促癌因子。我們將miR-141-3p mimic轉染至結腸癌細胞中,進行細胞功能學實驗,結果顯示miR-141-3p的上調可以促進結腸癌細胞的增殖,遷移并抑制細胞凋亡。說明miR-141-3p在體外結腸癌細胞中有促進細胞表型惡化的作用。

目前對于miR-141-3p 的研究報道顯示,其可以通過作用于多個靶基因發揮腫瘤調控作用,如SUSD2[10]、AK2[11]和NME1[12]等。我們利用多個靶向預測網站發現miR-141-3p與MYT1L的3’-UTR靶向結合,并利用雙熒光素酶實驗驗證了兩者的靶向結合關系。MYT1L可以將成纖維細胞重編程為神經元,MYT1L的調控機制與它的鋅指結構有關,可能是通過MYT1L與DNA特殊位點結合發揮生物學活性[13]。研究表明在人類成膠質細胞瘤細胞系中MYT1L的表達降低,MYT1L的表達上調會抑制成膠質細胞瘤細胞系的增殖,激活與神經元分化相關的基因表達程序,并限制細胞遷移和上皮間充質轉化基因集的表達[14]。所以我們推測miR-141-3p很可能通過靶向下調MYT1L的表達來調控結腸癌的發生和發展。因此,我們比較只轉染了pUC-MYT1L和轉染了pUC-MYT1L和miR-141-3 mimic兩組的細胞表型,結果可以得出miR-141-3p表達的上調抑制了MYT1L的表達,并且抑制了MYT1L對結腸癌細胞的增殖和遷移的下調作用。表明miR-141-3p可以靶向下調MYT1L的表達,從而促進結腸癌細胞的發生發展。

綜上所述,本研究確定了miR-141-3p對MYT1L在結腸癌細胞中的靶向調控作用。今后的研究中會探究MYT1L與信號通路之間的作用,并在其他結腸癌細胞系中進行研究。本研究可能為結腸癌的發生和發展過程的作用機制提供了一條新的見解,望能對其診斷、治療提供新的思路。本研究的不足之處為僅以結腸癌細胞株為研究對象,通過體外實驗對分子機制進行研究,后續還有待利用動物實驗等進行進一步驗證和完善。