辛芷通竅顆粒對慢性鼻竇炎小鼠鼻竇黏膜的保護機制研究

李群真,李 軍,郭樹繁,燕 茹,董學娜,馬鳳梅

(河北省中醫院耳鼻喉科,河北 石家莊 050011)

慢性鼻竇炎(Chronic rhinosinusitis,CRS)是一種常見的上呼吸道疾病,主要特征是鼻竇黏膜的慢性炎癥和黏液分泌增加。CRS嚴重影響患者生活質量,給社會和經濟帶來了巨大負擔。CRS的治療措施主要包括抗生素、抗炎藥物和手術等[1]。在目前的研究中,對CRS的病理生理機制已有一定了解,但仍存在一些局限性。首先,傳統的治療方法主要針對炎癥反應和黏液過度分泌進行干預,缺乏對疾病發生發展機制的全面認識。其次,現有的治療方法往往只能緩解癥狀,無法從根本上改變疾病進程[2]。因此,有必要尋找新的治療方法,深入研究慢性鼻竇炎的發病機制,提高治療效果。辛芷通竅顆粒作為一種傳統中藥方劑,由辛夷、蒼耳子、白芷、薄荷、麻黃、金銀花、黃芩、石膏、魚腥草、川芎、陳皮、甘草等組成,具有疏風通竅、清熱解毒功效,主要用于治療過敏性鼻炎[3]。有臨床研究表明,辛芷通竅顆?？娠@著改善CRS患者癥狀,減輕炎癥反應,提高生活質量,但具體機制尚不清楚[4-5]。因此,本研究旨在探討辛芷通竅顆粒對CRS小鼠鼻竇黏膜的保護作用及機制,以期為辛芷通竅顆粒的科學應用提供更多依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:50只6～8周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠,平均體重(22±2)g,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[實驗動物生產許可證號SCXK(滬)2008-0016]。遵循實驗動物的3R原則,所有小鼠均在相對濕度70%,環境溫度(24±2)℃,12 h明暗交替條件下喂養。

1.1.2 主要試劑:BCA蛋白定量試劑盒(貨號P0010,碧云天生物技術有限公司);RIPA裂解液(貨號P0013B,碧云天生物技術有限公司);4×蛋白上樣緩沖液(貨號RM00101,武漢愛博泰克生物科技有限公司);SDS-PAGE凝膠配劑盒(貨號G2003-50T,賽維爾生物科技有限公司);TRIzol試劑(貨號QN2070,北京百普賽斯生物科技股份有限公司);肺炎鏈球菌液(貨號B80921,寧波明舟生物科技有限公司);辛芷通竅顆粒(貨號Z20073039,四川同人泰藥業股份有限公司);ELISA試劑盒(貨號EKHU3748,迪信泰檢測科技有限公司)。一抗TNF-α(貨號3707,美國CST公司)、IL-6(貨號12153,美國CST公司)、IL-10(貨號12163,美國CST公司)、IL-16(貨號87477,美國CST公司)、IFN-γ(貨號98139,美國CST公司)、HMGB1(貨號3935,美國CST公司)、NLRP3(貨號15101,美國CST公司)、ASC(貨號67824,美國CST公司)、Cleaved caspase-1(貨號89332,美國CST公司)、GAPDH(貨號92310,美國CST公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠模型建立及給藥:適應性喂養1周后進行實驗。小鼠分籠飼養,每籠至多5只小鼠。飼養環境恒溫22～25 ℃,自由飲水飲食,晝夜12 h交替,定期更換墊料。采用隨機數字表法將50只小鼠分為假手術組、模型組、辛芷通竅低劑量組、辛芷通竅中劑量組、辛芷通竅高劑量組。采用開放上頜竇后接種3型莢膜型肺炎鏈球菌方法建立CRS小鼠模型。小鼠麻醉滿意后,于小鼠鼻背正中處做一橫行約3 mm的切口,鈍性分離皮下組織,暴露上頜竇腔,于上頜竇左右兩側開口處磨一個直徑約為1 mm的小孔。將含1 μl肺炎鏈球菌菌液的膨脹海綿植入竇腔內,逐層縫合皮膚。假手術組小鼠手術方式同模型組,但不植入含肺炎鏈球菌菌液的膨脹海綿。造模后第8周,記錄小鼠一般情況及癥狀評分,總分≥5分認為造模成功。辛芷通竅低劑量組予以1.4 g/kg辛芷通竅顆粒、中劑量組予以2.8 g/kg辛芷通竅顆粒、高劑量組予以5.6 g/kg辛芷通竅顆粒,均灌胃治療,相當于臨床用量的0.8、1.6、3.2倍,假手術組及模型組小鼠灌胃等量0.9%氯化鈉溶液。每天給藥1次,連續給藥2周。

1.2.2 HE染色:小鼠鼻竇黏膜組織經4%多聚甲醛固定后,梯度濃度的乙醇脫水,石蠟包埋。將組織塊切成5 μm厚的切片,依次進行蘇木精-伊紅染色、乙醇脫水,再經二甲苯透明,滴加樹膠、封片,在光鏡下觀察鼻竇黏膜組織病理改變。

1.2.3 ELISA法檢測外周血炎癥因子水平:末次給藥24 h后,采集小鼠腹主動脈無菌血。靜置1 h,室溫、3000 r/min條件下離心10 min,收集上層血清,-80 ℃保存。根據制造商說明采用ELISA法測定小鼠外周血TNF-α、IL-6、IL-10、IL-16、IFN-γ表達水平。

1.2.4 RT-qPCR檢測:根據制造商方案,使用Trizol試劑分離,提取鼻竇黏膜組織中總RNA。使用PrimerScript RT試劑盒(#RR037A,Takara)進行反轉錄。采用SYBR Premix Ex TaqTMTM Ⅱ檢測相應目的基因表達。擴增反應條件為:95 ℃預變性10 min,循環40次(95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s),以GAPDH為內參基因,采用2-ΔΔCt方法計算mRNA的相對表達量,基因引物序列,見表1。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot檢測:將小鼠鼻竇黏膜組織置于冰上加入裂解液進行裂解,提取總蛋白并定量。以40 μg蛋白/孔的標準進行電泳,電泳后轉移到聚偏二氟乙烯膜上,用牛血清白蛋白溶液封閉,與抗TNF-α、IL-6、IL-10、IL-16、IFN-γ、HMGB1、NLRP3、ASC、Cleaved caspase-1、GAPDH的一抗共同孵育,在4 ℃條件下孵育過夜。以GAPDH作為內參。用TBST洗膜3次,與二抗孵育1 h后使用增強型化學發光底物系統檢測蛋白印跡。

1.3 統計學方法 所有實驗獨立重復至少3次,采用SPSS 20.0統計學方法進行分析。計量資料以均數±標準差表示,多組間比較用單因素方差分析(ANOVA),兩兩比較采用LSD-t檢驗;P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況比較 造模前,各組小鼠精神狀態良好,皮毛健康有光澤,飲食飲水規律。造模后,各組小鼠飲食飲水明顯較少,且出現鼻水流出、頻繁撓鼻、打噴嚏、煩躁不安等癥狀,鼻腔內有少量分泌物出現,伴有不同程度的結膜水腫、眼角溢淚等表現。經過6周的藥物干預后,假手術組癥狀評分為(0.09±0.02)分、模型組癥狀評分為(8.49±0.61)分、辛芷通竅低劑量組癥狀評分為(3.19±0.45)分、辛芷通竅中劑量組癥狀評分為(2.56±0.39)分、辛芷通竅高劑量組癥狀評分為(2.09±0.22)分,組間比較差異有統計學意義(F=18.32,P<0.05)。辛芷通竅低劑量組、辛芷通竅中劑量組、辛芷通竅高劑量組小鼠鼻竇炎癥狀評分均低于給藥前,差異有統計學意義(均P<0.05),且辛芷通竅高劑量組小鼠鼻竇炎癥狀評分最低,辛芷通竅方呈明顯的劑量依賴性。

2.2 各組小鼠鼻竇黏膜病理情況比較 見圖1。假手術組小鼠鼻竇黏膜上皮細胞排列整齊,黏膜及黏膜下層有未見炎癥細胞浸潤。模型組小鼠鼻竇黏膜上皮纖毛脫落、炎癥細胞滲入、腺體損傷、血管擴張和水腫。辛芷通竅低劑量組、辛芷通竅中劑量組、辛芷通竅高劑量組小鼠鼻竇黏膜中上皮纖毛及腺體損傷現象,但與模型組相比,炎細胞浸潤程度、血管擴張和水腫程度相對較輕,鼻竇黏膜上皮細胞排列相對整齊,且辛芷通竅顆粒干預濃度越高,病變改善程度越明顯。

A:假手術組;B:模型組;C:辛芷通竅低劑量組;D:辛芷通竅中劑量組;E:辛芷通竅高劑量組

2.3 各組小鼠外周血炎癥因子水平比較 見表2。與假手術組相比,模型組小鼠外周血中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-16、IFN-γ水平較高,差異有統計學意義(P<0.05)。辛芷通竅低劑量組、辛芷通竅中劑量組、辛芷通竅高劑量組小鼠外周血炎癥因子水平低于給藥前,差異有統計學意義(P<0.05),且辛芷通竅高劑量組小鼠外周血炎癥因子水平最低,辛芷通竅中劑量組外周血炎癥因子水平次之,辛芷通竅低劑量組小鼠外周血炎癥因子水平最高,辛芷通竅方表現出明顯的劑量依賴性。

表2 各組小鼠外周血炎癥因子比較(pg/ml)

2.4 各組小鼠鼻竇組織中炎癥因子水平比較 見表3(圖2)。從本次觀察可見,RT-qPCR及Western blot檢測結果顯示,與假手術組相比,模型組小鼠鼻竇黏膜組織中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-16、IFN-γ的mRNA及蛋白相對表達較高,差異有統計學意義(均P<0.05)。辛芷通竅低劑量組、辛芷通竅中劑量組、辛芷通竅高劑量組小鼠鼻竇黏膜組織炎癥因子低于模型組小鼠水平,差異有統計學意義(P<0.05),且辛芷通竅顆粒呈劑量依賴性地抑制鼻竇黏膜組織中炎癥因子表達。

A:假手術組;B:模型組;C:辛芷通竅低劑量組;D:辛芷通竅中劑量組;E:辛芷通竅高劑量組

表3 各組小鼠鼻竇黏膜組織中炎癥因子mRNA表達比較

2.5 各組小鼠鼻竇黏膜HMGB1/NLRP3信號通路相關因子表達 見圖3。Western blot檢測結果顯示,與假手術組相比,模型組小鼠黏膜組織中HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表達升高。與模型組相比,辛芷通竅低劑量組、辛芷通竅中劑量組、辛芷通竅高劑量組小鼠鼻竇黏膜組織中HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1 蛋白表達降低,且呈辛芷通竅顆粒劑量依賴性。

A:假手術組;B:模型組;C:辛芷通竅低劑量組;D:辛芷通竅中劑量組;E:辛芷通竅高劑量組

3 討 論

中醫認為,鼻竇是人體衛氣之源,與肺經關系緊密[6-8]。生理情況下,鼻竇內的氣血運行順暢,能夠保持呼吸通暢以及鼻腔黏膜的正常功能,當外邪侵入或體內邪氣聚集-導致鼻竇黏膜受損,氣血瘀滯不暢,即會引發CRS[9-12]。辛芷通竅顆粒是一種中藥制劑,具有祛邪解表、宣發散寒作用,能夠祛除風寒邪氣,促進鼻竇血液循環,改善鼻竇黏膜的炎癥[13-15]。

本研究發現,模型組小鼠的正常鼻竇黏膜組織結構被顯著破壞,外周血炎癥因子水平最高;辛芷通竅顆粒各劑量組小鼠鼻竇黏膜中炎性細胞浸潤程度、血管擴張、水腫程度相對較輕,鼻竇黏膜上皮細胞排列相對整齊,外周血炎癥因子水平較低,且辛芷通竅顆粒干預濃度越高,病變改善程度越明顯,表明辛芷通竅顆粒中的活性成分具有鼻竇黏膜損傷的保護作用。可能的機制包括辛芷通竅顆粒中的活性成分具有抗炎作用,能夠減輕炎癥細胞滲出。炎癥細胞的積聚會產生炎癥介質,如TNF-α、IL-6等,這些介質會引起局部血管擴張和水腫。辛芷通竅顆粒通過抑制炎癥介質產生,減輕血管擴張和水腫程度;辛芷通竅顆粒也可能對鼻竇黏膜上皮細胞具有保護作用[16]。鼻竇黏膜上皮細胞的纖毛脫落是慢性鼻竇炎的典型特征,而辛芷通竅顆粒通過促進纖毛再生或抑制纖毛脫落過程,減輕鼻竇黏膜上皮纖毛損傷[17-18]。此外,辛芷通竅顆粒還能保護鼻竇黏膜腺體,減輕其受損程度。

HMGB1/NLRP3信號通路在CRS的病情進展中具有重要作用[12]。HMGB1是一種核蛋白,在細胞損傷和炎癥反應中釋放,并參與調節炎癥介質的產生[19]。NLRP3是一種炎癥小體成分,參與炎癥反應和細胞凋亡調控[20-23]。在包括CRS在內的慢性炎癥發展過程中,HMGB1和NLRP3的異?；罨c炎癥反應的持續存在密切相關,二者的激活可以導致炎癥介質的產生和炎癥反應的持續存在[24]。促進炎癥細胞因子的釋放和炎癥細胞浸潤,進一步加劇局部組織的炎癥反應。同時,HMGB1和NLRP3的異?；罨烧T導細胞凋亡和細胞損傷,誘導鼻竇黏膜的結構破壞和功能障礙,加重CRS嚴重程度[25-26]。本研究發現,辛芷通竅顆粒可有效抑制小鼠鼻竇黏膜中HMGB1/NLRP3信號通路激活,表明HMGB1/NLRP3信號通路是辛芷通竅顆粒治療CRS的重要靶點,通過調節炎癥反應失衡,抑制炎癥因子的持續改善。

綜上所述,本研究發現辛芷通竅顆粒呈劑量依賴性地抑制HMGB1/NLRP3信號通路激活,抑制CRS小鼠鼻竇黏膜炎癥水平。然而,CRS的發生發展涉及眾多因素,機制復雜,因此辛芷通竅顆粒改善CRS癥狀的具體機制仍有待進一步研究。