丹參-川芎藥對干預大鼠血管性癡呆作用機制

陳應奇,劉英蓮,梁 薇,姜子祥,韋 祎,李宏英,馬天鵬,姜 燕

(1.海南醫學院,海南 海口571199;2.寧波市鎮海區中醫醫院,浙江 寧波 315000)

血管性癡呆(Vascular dementia,VD)是由腦血管疾病(Cerebrovascular disease,CVD)所致,核心表現為大腦認知功能損傷的慢性進行性疾病[1]。相關臨床調查證實,VD的患病率已占全球中老年癡呆癥患者的20%～30%,并被列為“癡呆”的第二大類型,以意識功能受損為主,并伴有注意力、記憶力及執行力減退等癥狀。近年來,人口老齡化趨勢已是全世界面臨的共同問題,相應地心腦血管疾病和VD發病例數也隨之上升[2]。現代科研結果表明,在學習記憶的信息產生與貯存方面,海馬神經元所含神經細胞Ca2+、鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Calmodulin dependent protein kinase Ⅱ,CaMPKⅡ)、鈣調蛋白(Calmodulin,CaM)發揮著重要作用[3]。丹參-川芎這一藥對作為活血化瘀方中最常用組合,臨床上有許多關于活血化瘀的藥方或中成藥,但關于丹參-川芎藥對治療海馬神經細胞的作用研究鮮見報道。本實驗通過干預大鼠的學習能力,并檢測干預前后大鼠海馬 CaM、CaMPK Ⅱ的 mRNA 水平,探討丹參-川芎提取物對血管性癡呆認知功能的部分調控機制,為中醫藥診治 VD 提供實驗證據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:選取100只SPF級SD雄性大鼠,平均體重(250±20)g ,飼養在白晝循環模式采光,室溫為22 ℃左右。每日按時喂食、自由飲水,預養2周。

1.1.2 實驗藥物:尼莫地平片(國藥準字H13021882)、硝普鈉(國藥準字H20058958)、慶大霉素(國藥準字H42022058)。

1.1.3 實驗儀器:Morris 水迷宮(中國醫學科學院藥物研究所提供);電子分析天平(型號XPR226DRQ/AC);離心機(型號KH22,湖南凱達科學儀器有限公司);勻漿機(型號PRO200,FLUKO 公司);酶標儀(型號LD-96A,萊恩德智能科技);激光掃描共焦顯微鏡(型號STELLARIS)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組方法:雄性、健康的100只SD大鼠經由隨機方式歸入造模組(n=80)、正常組(n=10)、假手術組(n=10)。造模組先通過Morris水迷宮找出造模有效的50只血管性癡呆大鼠,再經由隨機手段歸入模型組(n=10)、尼莫地平組(n=10)、丹參-川芎高劑量組(n=10)、丹參-川芎中劑量組(n=10)、丹參-川芎低劑量組(n=10)。

1.2.2 造模:先對實驗動物行2周預養,自第15天起造模。造模方法為反復夾閉頸動脈,再注射硝普鈉降壓及單側永久性結扎頸動脈,實驗動物術前禁食、水[4]。呈仰臥位固定,按400 mg/kg用量予腹腔注射10%水合氯醛行麻醉處理,通過碘伏對頸部行常規消毒處理,頸正中切開,對組織行鈍性分離,暴露兩側頸總動脈(Common carotid artery,CCA)、頸內動脈(Internal carotid,ICA)、頸外動脈(External carotid artery,ECA)。于夾閉兩側CCA前,先腹腔注入2.0 mg/kg硝普鈉,借助無創動脈夾對兩側CCA行10 min夾閉操作,再將動脈夾去掉,通血10 min[5]。間歇阻斷雙側頸動脈血3次后,用鑷子隨后將一側頸總動脈挑起,血管下穿兩根縫合線,結扎一側頸總動脈,切口處滴注青霉素后縫合皮膚,碘伏消毒縫合處,保溫飼養。假手術組只需對兩側頸動脈行分離操作,為了防范感染,術畢肌注慶大霉素。

1.2.3 模型篩選:通過Morris水迷宮完成對癡呆鼠的篩選。水池為120 cm直徑,水深30 cm左右,平臺為10 cm直徑(相較水面偏低2 cm左右)。將池壁等分為四個象限,各象限池壁中點就是各象限的入水點,平臺固定于某一象限內距離池壁約30 cm的位置。單獨測試每只實驗動物[6]。在測試環節對每只動物分別自4個象限入水點1次。觀察記錄大鼠從入水尋找并爬上平臺所需的時間(這個時間被稱為逃避潛伏期;并讓其在平臺上休息1 min后再進行下次測試,如果超過90 s未能找到平臺,將其引導到平臺,該逃避潛伏期記錄為90 s。分別記錄每只大鼠4次入水到找到平臺所需時間,取4次的平均值為該鼠每天的逃避潛伏期。建模后經過2周(手術傷口已徹底愈合)開始訓練大鼠,1次/d,合計5 d。把第5天正常組實驗動物逃避潛伏期的均值當作參考值,對各造模動物第5天的逃避潛伏期均值與參考值的差值與參考值做比值,若此值在20%以上,表示建模有效[6]。

1.2.4 干預方法:待有效完成模型篩選工作,對各組動物開始實施相應操作,1次/d,6次/周,共處理4 周,藥物人常用劑量為丹參、川芎各10 g,按照體表面積轉換動物藥物用量,于每日早晨 8:00 灌胃。丹參-川芎高劑量組40 mg/kg、丹參-川芎中劑量組20 mg/kg、丹參-川芎低劑量組10 mg/kg、尼莫地平組20 mg/kg干預;正常組、假手術組、模型組皆給予相應藥物溶劑等量的0.9%氯化鈉溶液干預;各組給藥頻率為1次/d、6次/周,共干預4周。

1.2.5 行為學檢測:在造模前1周、造模后1周及進行相應干預措施結束后1周,各組大鼠均采取水迷宮測試,定位航行試驗記錄大鼠逃避潛伏期,空間探索試驗記錄在撤出平臺后大鼠穿越原平臺象限的次數。各組間數據分為定位航行試驗、空間探索試驗兩大項,以此對各組大鼠的學習記憶功能變化進行評價。

1.2.6 實驗室指標檢測:腹主動脈引出盡可能多的血液后,斷頭處死實驗動物,同時快速將其腦組織取出,通過冰冷0.9%氯化鈉溶液將殘留血液除掉,隨后分離出海馬組織,稱重后裝入凍存管中迅速置于液氮,保存備用待檢測。激光掃描,共焦顯微鏡觀察海馬神經細胞[Ca2+] i。各組分別選擇 5 只動物兩側海馬組織,通過冷胰蛋白酶(Trypsin)消化法完成對神經細胞的分離,借助微量加樣器將1 μl熒光探針 Fluo-3滴加于在蓋玻片上貼壁的海馬神經細胞懸浮液。觀察工具為激光掃描共焦顯微鏡,反射光、激發光各設定為530、488 nm,對各視野神經細胞實施激光掃描查看細胞中[Ca2+]i,并對細胞中熒光像素的相對值記錄。

1.2.7 RT-qPCR 半定量檢測 mRNA 表達:快速分離各組大鼠海馬,液氮中保存。用總 RNA 抽提試劑(Trizol 試劑)提取總RNA 后,反轉錄合成 cDNA 第一鏈,并將其當作模板,各自對 CaM、CaMPKⅡ受損PCR 擴增處理,內參為β-actin 。引物信息見表1。

表1 各基因引物信息

2 結 果

2.1 各組大鼠干預前定位航行試驗比較 見表2。干預前,各組大鼠前3 d的訓練情況比較均無差異,組間因素與正常訓練天數之間沒有交互作用。第 4天起,正常組與造模組開始不同,差異有統計學意義(P<0.05)。干預前第4、5天,各給藥組間大鼠定位航行試驗比較,差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠干預前不同時間定位航行試驗比較(s)

2.2 各組大鼠干預后定位航行試驗比較 見表3。各組大鼠在接受干預后第1天,正常組與其他各組定位航行試驗比較,差異無統計學意義(P>0.05)。干預第 2天,正常組與其他各組定位航行試驗比較,差異有統計學意義(P<0.01)。干預第5天,丹參-川芎高劑量組與尼莫地平組定位航行試驗比較,差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠干預后不同時間點定位航行試驗比較(s)

2.3 各組大鼠干預前后空間探索試驗比較 見表4。干預后,正常組、假手術組、模型組、尼莫地平組、丹參-川芎高劑量組、丹參-川芎中劑量組、丹參-川芎低劑量組的空間探索試驗結果均高于干預前。干預后,尼莫地平組、丹參-川芎高劑量組、丹參-川芎中劑量組、丹參-川芎低劑量組空間探索試驗結果均低于正常組和假手術組。丹參-川芎高劑量的空間探索試驗結果與尼莫地平組比較,差異無統計學意義(P>0.05),而丹參-川芎高劑量組高于丹參-川芎低劑量組,差異有統計學意義(P<0.01)。

表4 各組大鼠干預前后空間探索試驗比較(次)

2.4 各組大鼠干預后 [Ca2+]i熒光像素相對值比較 見表5。模型組的[Ca2+]i熒光像素相對值高于正常組,差異有統計學意義(P<0.01)。干預后,接收藥物干預的各組[Ca2+]i熒光像素相對值低于模型組,差異有統計學意義(P<0.05)。干預后,丹參-川芎高劑量組[Ca2+]i熒光像素相對值與尼莫地平組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。丹參-川芎高劑量組[Ca2+]i熒光像素相對值低于丹參-川芎中劑量組、丹參-川芎低劑量組,差異有統計學意義(P<0.05)。

表5 各組大鼠干預后[Ca2+]i熒光像素相對值比較

2.5 各組大鼠干預后海馬神經細胞CaM、CaMPKⅡ的mRNA表達比較 見表6。干預后,模型組CaM、CaMPKⅡ的mRNA含量低于正常組,差異有統計學意義(P<0.01)。干預后,丹參-川芎高劑量組CaM、CaMPKⅡ的mRNA含量高于尼莫地平組、丹參-川芎中劑量組、丹參-川芎低劑量組,差異有統計學意義(P<0.05)。

表6 各組大鼠干預后海馬神經細胞CaM、CaMPKⅡ的 mRNA 表達比較

3 討 論

VD為現代醫學的命名,在中醫學文獻中與之匹配的病型歸屬于“呆病”范疇,其主要表現為健忘,病機與“瘀”相關,歷代醫學典籍中散在提及此類疾病[7]。“年五十以上,陽氣日衰……心力漸退,忘前失后”[8]。《雜病源流犀燭》中提到的“中風后,善忘”等[9]。首次對“呆病”提出專論是明代《景岳全書·雜證謨》,而清代陳士鐸《辨證錄》單獨提出“呆病門”,對呆病癥狀詳細描述,并闡明成因、病機、病理轉化過程,其主要與腦相關;而腦又被稱為髓海,血能滋養腦髓,是將精微上供于腦髓的主要載體[10]。血液的正常運行與臟腑功能、氣機運轉、脈道通利等機體內外環境因素關系密切。凡是能促使血液運行不暢或離開經脈的各種因素,導致瘀血的形成。現代研究證實,血瘀證和腦灌注異常、血液流變學異常、血流動力學、微循環受限等存在緊密聯系,VD患者有不同程度的血液流變學異常表現,如聚、濃、凝、黏等[11]。ASL-MRI、CTA、TCD等腦血管相關檢查發現,相當數量的VD患者存在血管動脈粥樣硬化、血管狹窄、血管閉塞、血管瘤、先天血管異常、血液灌注不足等[12]。心臟附壁血栓、原發性血管炎、免疫性血管疾病、動脈粥樣硬化斑塊引起腦栓塞等腦血管病亦與中醫血瘀證相關[13]。

中藥在治療癡呆方面有一定優勢,中藥治療呆病歷史悠久,古代醫家留下很多治療癡呆的寶貴經驗[14]。我國地勢復雜,中草藥類型多樣。研究發現,活血化瘀藥物如丹參、川芎、葛根、雞血藤等具有改善血液流變學,增加腦血流作用[15]。《日華子本草》記載川芎具有“破癥結宿血,養新血……,及排膿消瘀血”的作用,《本草綱目》記載丹參有“活血,通心包絡”功效,在治療瘀血內阻型老年癡呆中丹參的運用尤為重要[16-17]。川芎與丹參同用,可助川芎活血行氣祛瘀之力,川芎、丹參相配既可入血分又可入氣分,氣隨血行,從而活血化瘀,讓滯留于腦府脈絡的瘀血消散,是治療癡呆常用的活血化瘀藥對。現代藥理學對川芎、丹參單味藥有研究,川芎水提物中與抗血小板聚集活性的關系最為密切,可改善腦循環;丹參中的丹參酮具有抗凝血作用,有利于增加腦局部血液供應,防止血栓和動脈粥樣硬化形成,這可能與其抗炎、抗氧化、下調血脂等調節機制激活相關[18-19]。“丹參-川芎”藥對的作用靶點分布在多種細胞組分中,主要以胞質為主,通過多種結合方式參與生物進程,有抗小動脈硬化、抗血小板聚集、預防血栓的形成作用,且能改善腦血管微循環[20]。

現代研究結果表明,對于學習與記憶的形成與維持,海馬神經元細胞功能與形態發揮著核心作用。正常情況下,鈣離子在細胞內可作為第二信使C與aM結合生成復合物,但 CaMPKⅡ是處于靜止狀態[21]。當細胞受外界刺激時,CaMPKⅡ會被激活,然后與復合物結合形成新復合物,使細胞內的鈣離子水平又恢復到基礎狀態。同時 CaMPK Ⅱ快速出現自身磷酸化,對Ca2+失去依賴性,此自身磷酸化能夠使CaMPK Ⅱ留存先前活化Ca2+信號,這與記憶產生與存儲相關[22-23]。

本實驗結果顯示,干預前在熟悉環境并獲取空間信息后各組大鼠表現記憶方面的能力存在差異,造模各組大鼠在尋找平臺的效率上開始落后于正常組,VD大鼠的空間參考記憶力明顯受損。干預后,各治療組大鼠在尋找及穿越平臺的效率明顯優于模型組,丹參-川芎高劑量組與尼莫地平組無差異,接近正常組。模型組[Ca2+]i含量明顯增高,而CaM、CaMPKⅡ的mRNA表達量減少;各治療組Ca2+的含量明顯減少,CaM、CaMPKⅡ mRNA表達量明顯增多,丹參-川芎高劑量組與尼莫地平組Ca2+的含量相當,均低于丹參-川芎中劑量組、丹參-川芎低劑量組;丹參-川芎高劑量組與尼莫地平組CaM、CaMPKⅡ的mRNA含量增多,且均高于丹參-川芎中劑量組、丹參-川芎低劑量組。實驗表明,腦部缺血、缺氧后導致鈣離子通道異常,海馬組織的神經細胞[Ca2+]i會增多,使得Ca2+在細胞內大量聚積,Ca2+過量可減弱腺苷酸環化酶(Adenylate cyclase,AC)功能,并將磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE)活化,從而使cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response-element protein,CREB)的生成量下降,細胞中cAMP濃度減少[24]。cAMP水平降低,減少蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)激活,使cAMP磷酸化受到嚴重抑制,對CRE轉錄啟動下游基因活動不利[17]。然而,CRE 的啟動障礙降低了CaM,CaMPKⅡ的mRNA 轉錄水平[25]。丹參-川芎藥對能有效抑制其表達,證明丹參-川芎藥對通過降低海馬細胞內[Ca2+]i熒光強度作用機制,控制CaM、CaMPK Ⅱ的mRNA表達量。實驗結果顯示,丹參-川芎藥對成功阻止了VD大鼠海馬神經細胞[Ca2+]i過量增加和CaM、CaMPKⅡ的mRNA 表達下降,且對于 VD 大鼠臨床癥狀也能有效改善,為臨床深入研究丹參-川芎治療 AD 作用機制提供參考。