狼瘡性腎炎患者腎組織差異表達基因篩選及功能分析

郭文濤,劉瑛琦,王 希,郜趙偉,李銳成△

1.空軍軍醫大學第二附屬醫院檢驗科,陜西西安 710038;2.空軍軍醫大學基礎醫學院四大隊,陜西西安 710038

系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種多發于中青年女性的自身免疫性疾病,可引起全身各系統各臟器的損傷。其中,SLE所致腎臟受累,可引起狼瘡性腎炎(LN),是SLE所引起的最常見器官損傷之一,可表現為血尿、蛋白尿、腎功能不全、免疫復合物沉積等[1]。LN所致的嚴重腎臟損傷是SLE患者的主要死亡原因之一。LN的發病機制目前尚不清楚。本研究利用基因表達數據庫(GEO),篩選LN患者腎臟組織中差異表達基因(DEGs),同時,關注DEGs在LN患者外周血單個核細胞(PBMC)中的表達情況,為探討LN發病機制提供理論依據,并為LN發掘潛在的治療靶點。

1 資料與方法

1.1一般資料 GSE32591數據集包括如下轉錄組信息:32例LN腎小管間質和15例正常腎小管間質;32例LN腎小球和14例正常腎小球;GSE112943數據集包括14例LN腎組織和7例正常腎組織的轉錄組信息;GSE81622數據集包括15例LN患者PBMC和25例健康對照PBMC的轉錄組信息。

1.2方法

1.2.1DEGs篩選 利用GEO2R分析工具對數據集進行分析,篩選LN腎組織中的DEGs(log2FC≥1或≤-1且P<0.01),對3組DEGs取交集,得到共有的DEGs。

1.2.2基因本體(GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 利用DAVID生物信息分析工具(version 6.8,https://david.ncifcrf.gov/)對DEGs進行GO注釋和KEGG分析,利用R軟件(version 4.0.2)制作氣泡圖對GO和KEGG分析結果進行可視化。

1.2.3蛋白互作網絡(PPI)分析 利用STRING在線數據庫(https://www.string db.org/)對DEGs編碼蛋白進行PPI構建,篩選聯合評分>0.9的高置信度互作節點數據,互作類型或證據來源包括:實驗驗證、數據庫、共表達、基因融合及共定位。利用K-means及MCL聚類進行PPI的Clusters分析,篩選核心DEGs。分析核心DEGs在LN患者PBMC中的表達變化情況。

1.3統計學處理 DEGs利用t檢驗的P值和差異倍數進行篩選,篩選標準:|log2FC|≥1及P<0.01。對DEGs進行GO及KEGG分析,雙側檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1DEGs篩選結果 根據DEGs篩選標準,分別在GSE10325數據集的LN腎小管間質、腎小球及GSE112943數據集的LN腎組織中篩選到124 345和8 633個DEGs。取交集后,共篩選到45個共有DEGs,其中37個基因表達上調,8個基因表達下調。見圖1。

注:A為Venn圖顯示DEGs數量;B為45個共有DEGs在3組數據集中的表達變化情況。

2.2共有DEGs的功能分析 利用DAVID對LN腎組織中的45個DEGs進行GO和KEGG分析。GO功能注釋包括生物學過程(GO_BP)、細胞組成(GO_CC)及分子功能(GO_MF)。結果顯示,上述DEGs主要參與對病毒的響應、Ⅰ型干擾素信號通路、病毒防御、病毒基因組復制負調控、干擾素響應、固有免疫響應等生物學過程;主要位于細胞質、溶酶體膜及細胞外基質;分子功能包括RNA結合、GTP結合、解旋酶活性、MHCⅡ受體活性。KEGG通路分析顯示,上述DEGs主要參與的信號通路包括單純皰疹病毒感染、麻疹病毒感染、EB病毒感染、金黃色葡萄球菌感染等。見圖2。

注:A為GO_BP分析結果氣泡圖;B為GO_CC及GO_MF分析結果氣泡圖;C為KEGG分析氣泡圖。

2.3DEGs編碼蛋白互作分析 通過PPI構建和聚類分析,構建1個核心PPI模塊,共包含12個基因:早期生長反應蛋白1(EGR1)、FosB原癌基因(FOSB)、干擾素α誘導蛋白27(IFI27)、干擾素α誘導蛋白6(IFI6)、干擾素誘導的三角形四肽重復蛋白2(IFIT2)、干擾素誘導的三角形四肽重復蛋白3(IFIT3)、干擾素誘導的跨膜蛋白1(IFITM1)、干擾素誘導的跨膜蛋白3(IFITM3)、干擾素誘導的GTP結合蛋白Mx1(MX1)、干擾素誘導的GTP結合蛋白Mx2(MX2)、2′5′寡核苷酸合成酶1(OAS1)、XIAP相關因子1(XAF1)。在12個核心DEGs中,除FOSB僅與ERG1發生關聯外,其余11個基因均相互關聯。見圖3。

注:A為12個核心DEGs;B為核心DEGs的互作基因數量。

2.4PPI核心DEGs在LN患者PBMC中的表達分析 利用GSE81622數據集,對12個關鍵DGEs在LN患者PBMC中的表達情況進行分析。與LN腎組織中的表達變化情況相一致的基因有9個:IFI27、MX1、IFITM3、IFI6、IFIT3、IFIT2在LN患者PBMC中表達顯著上調(P<0.01),而且上調倍數大于2;MX2、OAS1、XAF1在PBMC中表達上調(P<0.01),上調倍數小于2。此外,不一致的基因有3個:IFITM1和FOSB在LN患者PBMC中改變差異無統計學意義(P>0.05),與LN腎組織中的表達變化不一致;EGR1在LN患者PBMC中表達上調(P=0.024),與LN腎組織中的表達變化情況相反。見表1。

表1 LN腎組織中12個DEGs在PBMC中的表達變化分析

3 討 論

利用基因表達公共數據庫,是篩選疾病相關關鍵基因的重要手段。本研究利用包含LN腎組織及其正常對照組織轉錄組數據集,共獲得了37個表達上調及8個表達下調DEGs。功能富集分析表明,45個DEGs主要與機體對病毒感染的響應及干擾素信號調控相關。進一步通過PPI分析獲得12個核心DEGs,分別為:EGR1、FOSB、IFI27、IFI6、IFIT2、IFIT3、IFITM1、IFITM3、MX1、MX2、OAS1、XAF1。大多數DEGs均為干擾素信號通路相關基因。其中,EGR1在LN腎組織中表達下調,其余11個DEGs均表達上調。

LN是一種自身免疫性疾病,包括病毒感染在內的各種因素引起的免疫調節紊亂(促炎癥免疫因素的過度產生和抑炎癥免疫因素的抑制)。自身免疫反應和自身抗體的形成既是患者重要的臨床特征,也是LN發生發展的重要驅動因素。TRIZZINO等[2]最近的研究顯示,EGR1能夠抑制巨噬細胞中促炎癥基因的表達,抑制發育中和成熟的巨噬細胞中的炎癥增強子的功能,從而削弱其活性和免疫反應。因此,LN腎組織中EGR1表達水平的下調可能導致其對巨噬細胞促炎癥反應抑制能力不足,導致過激炎癥反應,促進LN發展。有研究報道了EGR1在SLE患者中表達上調[3]。KOPEC等[4]研究發現EGR1表達降低與自身免疫性肝病小鼠的肝纖維化損傷相關,提示EGR1在自身免疫病組織損傷過程中發揮重要作用。

FOSB是Fos基因家族成員之一,其編碼蛋白是轉錄因子復合體AP-1的組成部分,參與調控細胞的增殖及分化。FOSB在SLE中的研究鮮見報道。FOSB在LN腎組織中的表達升高提示LN腎組織中相關細胞的增殖發生異常,此外,LN患者PBMC中FOSB表達無變化。PPI分析顯示,FOSB與EGR1之間存在互作,提示可能共同參與調控LN腎組織中的巨噬細胞增殖及活性。

XAF1是XIAP相關因子1,XIAP是X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白。目前的研究顯示,XAF1在促進細胞凋亡過程中發揮重要作用[5]。在正常情況下,機體內的凋亡細胞會被及時清除,然而,當清除機制發生異常時,凋亡細胞增多便會導致細胞內容物外泄產生自身抗原,從而引發自身免疫性炎癥和產生自身抗體。有研究顯示,SLE患者體內巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬能力降低[6-7]。因此,XAF1的促細胞凋亡作用,可能會導致自身抗原大量釋放,促進自身免疫的發生發展。已有研究發現,XAF1在多種自身免疫性疾病患者中表達異常,包括干燥綜合征[8-9]和系統性硬化[10]。XIANG等[11]在盤狀紅斑狼瘡患者中也發現了XAF1的表達變化,表明XAF1在SLE發生發展中作用關鍵。

干擾素是一類多功能的細胞因子,生物功能廣泛,在天然免疫應答中發揮重要作用。IFN分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。干擾素與其受體結合后,可以誘導幾百種基因的表達。本文篩選到的核心DEGs IFI27、IFI6、IFIT2、IFIT3、IFITM1、IFITM3、MX1、MX2、OAS1、XAF1均屬于干擾素誘導基因,其在LN腎組織中表達水平均升高,并且其中絕大多數基因在LN的PBMC中表達也上調,表明IFN信號通路活性在LN患者中上調,在LN發生發展過程中具有關鍵作用。KHAMASHTA等[12]通過隨機雙盲對照臨床研究發現,抗IFN-α單抗Sifalimumab治療可以明顯緩解SLE患者的病情。最近,一種Ⅰ型干擾素受體抗體藥物-Saphnelo獲FDA批準,用于治療正接受標準治療的中重度成人SLE患者[13],臨床研究數據顯示,靶向封閉Ⅰ型干擾素受體,Saphnelo明顯降低SLE疾病活動度[14-16],其常見不良反應之一即增加了患者帶狀皰疹感染的風險。由此可見,封閉IFN信號通路活性可能成為LN患者潛在的有效治療手段,更好的靶點選擇有利于增強療效,降低不良反應。本文篩選的LN腎組織中表達上調的IFN信號相關基因為治療靶點的選擇提供參考。

本研究篩選了LN腎組織中12個關鍵表達差異基因,并對其功能進行了分析,為LN發生發展分子機制提供理論參考。需要注意的是,LN腎組織中DGEs的表達變化方向(上調/下調)與其在LN患者PBMC中的變化方向并不完全一致,表明LN病理組織及其微環境與機體循環中的分子信號變化存在顯著不同。下一步需要在相關的細胞及SLE動物模型中對上核心基因進行功能驗證。