慢性高氧對(duì)小鼠肺功能的影響研究

唐俊，李可欣，張鳳梅

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院，重慶 400030；3.重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，重慶 400016）

支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是一種復(fù)雜的過程，一些產(chǎn)前和/或產(chǎn)后因素會(huì)干擾下呼吸道發(fā)育，導(dǎo)致嚴(yán)重的終身疾病。Northway[1]等于1967年首次使用術(shù)語“支氣管肺發(fā)育不良”來描述需要機(jī)械通氣的早產(chǎn)兒中由氣壓傷和氧損傷引起的慢性肺部損傷。BPD的病理特征表現(xiàn)為隔膜減少和肺泡發(fā)育不全，導(dǎo)致大肺泡簡(jiǎn)化，氣體交換面積減少。肺血管平滑肌增生，肺泡毛細(xì)血管異常，間質(zhì)纖維增生和肺泡隔膜增多，病死率和再入院率較高[2]。氧療是通過消除缺氧因素后來治療缺氧的治療措施，是導(dǎo)致BPD的高危因素之一[3]。高濃度氧容易在體內(nèi)形成損害肺部的高活性氧自由基，對(duì)患兒的遠(yuǎn)期發(fā)育具有一定影響[4,5]。BPD引起的慢性呼吸道疾病是早產(chǎn)最常見的長(zhǎng)期并發(fā)癥。近年來對(duì)BPD發(fā)病機(jī)制的了解有所增加，但BPD導(dǎo)致肺損傷的機(jī)制尚未完全闡明。目前的治療方法主要有控制感染肺、保護(hù)性通氣、氧療，給以NO等，但常用的治療措施效果較為有限，暫無特效藥物及其他治療方法[6]。

BPD可導(dǎo)致嚴(yán)重的肺損傷[7,8]，可持續(xù)性造成肺功能減弱。雖然肺損傷是BPD的標(biāo)志性特征，但文獻(xiàn)報(bào)道的多種高氧誘導(dǎo)BPD動(dòng)物模型均無法對(duì)肺功能進(jìn)行充分評(píng)估。目前大多研究是通過HE染色和定量組織學(xué)肺損傷評(píng)分評(píng)估肺功能，但這些方法均無法有效地評(píng)價(jià)肺功能。因此，本研究旨在探討慢性高氧對(duì)小鼠氣道阻力及肺功能的影響，為研究BPD肺功能提供參考。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心采購(gòu)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)為SCX K(渝)2022-0 010的SPF級(jí)C57BL/6J新生小鼠。該實(shí)驗(yàn)在重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(渝)2022-0016。

（二）儀器設(shè)備

無創(chuàng)動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀(FinePointe?NAM)、100%醫(yī)用氧氣(重慶朝陽氣體有限公司)、數(shù)字測(cè)氧儀（CY-100，杭州立華儀器有限公司）。

（三）模型制備

隨機(jī)將20只出生24h內(nèi)的SPF級(jí)的C57BL/6J小鼠分為對(duì)照組和高氧組，每組10只。在自制的密閉氧箱中（40cm×30cm×25cm）放置高氧組小鼠，持續(xù)緩慢輸入100%的氧氣，使 FIO2保持在85%左右，并將空氣組放置在同一室內(nèi)[9]。每天將高氧組與對(duì)照組的母鼠進(jìn)行更換，避免氧濃度過高導(dǎo)致中毒，降低其喂養(yǎng)能力。每日開箱1h，完成稱重、加水、加料及換墊料等工作。高氧干預(yù)21天后進(jìn)行肺功能檢測(cè)，使用4%多聚甲醛固定各組小鼠左肺，右肺于-80℃進(jìn)行凍存。

（四）小鼠基礎(chǔ)肺功能測(cè)定

使用FinePointe? NAM動(dòng)物肺功能儀器對(duì)各組小鼠進(jìn)行基礎(chǔ)肺功能檢測(cè)。日齡為21d時(shí)，每組隨機(jī)取5只小鼠。將處于清醒、活動(dòng)自如狀態(tài)的小鼠類放入全身體積描計(jì)箱，待其穩(wěn)定后，持續(xù)監(jiān)測(cè)肺功能指標(biāo)變化10min并計(jì)算平均值[10]。

（五）肺組織形態(tài)學(xué)分析

將左肺固定于4%多聚甲醛24h后，經(jīng)脫水透明和石蠟包埋，切片為4～5μm，經(jīng)脫蠟水化后，制成HE染色切片，在光鏡下觀察組織病理和形態(tài)的變化。

1.放射狀肺泡計(jì)數(shù)（Radical alveolar counts,RAC）

每組隨機(jī)抽取3～5個(gè)樣本，每個(gè)樣本隨機(jī)選取一個(gè)切面，每個(gè)切面隨機(jī)選取5個(gè)不重疊視域（×200），以每個(gè)視域下肺泡的平均數(shù)為肺泡計(jì)數(shù)[11]。

2.平均肺泡截距（Mean linear intercept，MLI）

在顯微鏡視域（×200）中央畫十字交叉線，對(duì)所有與交叉線相交的肺泡間隔數(shù)(NS)進(jìn)行計(jì)算，進(jìn)行十字線總長(zhǎng)(L)的測(cè)算；對(duì)每個(gè)視域的平均內(nèi)襯間隔計(jì)算(MLI=L/NS)，取其平均數(shù)，表示肺泡平均內(nèi)徑[12]。

（六）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

資料分析采用SPSS 21.0軟件，兩組資料均經(jīng)過t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

（一）不同組21日齡小鼠的體重及死亡率的比較

對(duì)照組的小鼠狀態(tài)正常，體重隨日齡上升。21天時(shí)空氣組、高氧小鼠體重分別為(7.84±0.24)g，(5.21±0.61)g。空氣組、高氧組21日齡小鼠的存活率分別為100%、70 %，如圖1所示。

圖1 慢性高氧影響新生鼠體重及生存率

（二）慢性高氧導(dǎo)致小鼠肺組織發(fā)育受損

與對(duì)照組相比，高氧組小鼠肺泡間隔變厚、破裂，肺泡數(shù)量減少，且肺泡腔變大(圖2)。高氧組MLI明顯升高，RAC值明顯下降，這表明高氧組小鼠肺組織功能不全，發(fā)育受阻。

圖2 小鼠肺組織病理形態(tài)改變(HE，200 ×)

圖3 各組小鼠肺功能比較

（三）小鼠的肺功能變化

與對(duì)照組相比，高氧組的呼吸頻率（Frequency of breathing，F(xiàn)），潮氣量（Tidal volume，TV），肺通氣量（Minute volume，MV），呼氣峰流速（Peak expiratory flow，PEF），吸氣峰流速（Peak inspiratory flow，PIF）、50%呼氣流量（The Expiratory Flow at 50% Expired Volume，EF50）值均降低。特異性氣道阻力（Specific airway resistance，SRAW）明顯增加，表明慢性高氧導(dǎo)致小鼠的肺功能受損。

（四）慢性高氧對(duì)遠(yuǎn)期肺發(fā)育的影響

為了進(jìn)一步探討慢性高氧對(duì)小鼠遠(yuǎn)期發(fā)育的影響。將高氧組小鼠置于85%O2處理21天后，將小鼠置于正常室內(nèi)空氣中喂養(yǎng)（21%O2）至小鼠8周齡，檢測(cè)其肺形態(tài)學(xué)及肺功能的變化。與對(duì)照組相比，高氧組小鼠肺泡腔擴(kuò)大，肺泡數(shù)量減少，肺發(fā)育紊亂(圖4)。

圖4 慢性高氧對(duì)遠(yuǎn)期小鼠肺發(fā)育的影響

（五）慢性高氧對(duì)遠(yuǎn)期肺功能的影響

與對(duì)照組相比，高氧組的呼吸頻率、肺通氣量值顯著降低，而特異性氣道阻力顯著增加，表明慢性高氧導(dǎo)致小鼠遠(yuǎn)期肺功能受損（圖5）。

圖5 慢性高氧對(duì)遠(yuǎn)期小鼠肺功能的影響

三、討論

肺發(fā)育可以概括為五個(gè)階段：胚胎期、假腺期、小管期、囊泡期和肺泡期，這一發(fā)育過程從宮內(nèi)生命早期開始，并在出生后的第一年繼續(xù)進(jìn)行。越來越多的證據(jù)表明，早期暴露于氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致肺部發(fā)育過程改變，使肺部更容易患上許多早產(chǎn)兒的典型疾病，例如呼吸窘迫綜合征、支氣管肺發(fā)育不良和持續(xù)性肺動(dòng)脈高壓等。正常的肺泡發(fā)育是由體積大、數(shù)量少的囊泡向體積小、數(shù)量多的肺泡轉(zhuǎn)化的過程，但在肺泡發(fā)育的囊泡形成期將新生動(dòng)物暴露于高氧下，使肺泡正常發(fā)育過程受阻，肺泡腔擴(kuò)大、數(shù)量減少，肺泡正常結(jié)構(gòu)消失，肺泡隔膜增厚，肺組織纖維化，即囊泡期向肺泡發(fā)育期的轉(zhuǎn)化受到阻滯。這一過程可以模擬人類新生兒BPD的病理特征[13-15]。

肺功能是呼吸系統(tǒng)疾病必不可少的檢查之一，在疾病診斷、病情發(fā)展、預(yù)后評(píng)估等方面都有廣泛的應(yīng)用，在臨床上意義重大[16]。F、MV、TV、PEF、PIF等是臨床常用反映肺功能的重要指標(biāo)。本研究通過使用85%高氧誘導(dǎo)21d成功建立新生兒支氣管肺發(fā)育不良的動(dòng)物模型，與正常組小鼠相比，高氧組小鼠發(fā)育緩慢，21d體重較輕，死亡率升高。通過HE染色研究?jī)山M小鼠肺組織病理形態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，高氧組小鼠肺泡腔擴(kuò)大，肺泡數(shù)量減少，肺發(fā)育紊亂。通過肺功能儀對(duì)各組小鼠進(jìn)行基礎(chǔ)肺功能檢測(cè)，結(jié)果顯示，高氧組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，特殊氣道阻力增加，F(xiàn)、MV、TV、Frc、PIF、PEF、EF50值均顯著下降，提示高氧可致小鼠肺損傷。接下來，本研究對(duì)慢性高氧對(duì)遠(yuǎn)期肺發(fā)育及肺功能的影響進(jìn)行了探索，將高氧組小鼠置于85% 高氧處理21d后，將小鼠 置于正常室內(nèi)空氣中喂養(yǎng)至8周齡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，高氧組小鼠在正常環(huán)境成長(zhǎng)至8周齡時(shí)，肺發(fā)育仍然相對(duì)緩慢，且肺功能受損情況仍未改善，這表明高氧對(duì)小鼠發(fā)育期及遠(yuǎn)期肺功能均有較大損害。近期有文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，在嬰兒期被診斷患有支氣管肺發(fā)育不良的兒童患有呼吸系統(tǒng)疾病風(fēng)險(xiǎn)較正常兒童更高，發(fā)育中的肺暴露于高氧會(huì)導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡、炎癥增加和肺水腫，這些不良因素可能導(dǎo)致青少年乃至成人時(shí)期呼吸系統(tǒng)疾病風(fēng)險(xiǎn)增加和肺功能下降[17]。

綜上所述，慢性高氧可誘導(dǎo)新生鼠肺發(fā)育不良、損害肺功能，并對(duì)遠(yuǎn)期肺發(fā)育產(chǎn)生持續(xù)影響。本研究為研究BPD機(jī)制及治療方法提供了理想的動(dòng)物模型，奠定了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和重要的理論基礎(chǔ)。