HPLC和原子吸收光譜法測定黃芩苷鋅含量的比較研究

余瑞雪,陳 蓉,李亞龍,葉 純,邱銀生

(武漢輕工大學動物科學與營養工程學院,武漢 430023)

仔豬腹瀉是困擾養殖業的一大難題[1],黃芩苷能夠抑制炎性滲出、降低致炎細胞因子的釋放從而治療仔豬腹瀉[2]。黃芩苷預防治療仔豬腹瀉的效果已經得到廣泛的證實,也在臨床上大量投入使用[3]。有研究發現,黃芩苷與金屬離子形成的絡合物其藥理活性優于黃芩苷[4]。鋅元素是動物生長和發育必不可少的微量元素,前期研究發現,黃芩苷和鋅離子的配合物比黃芩苷具有更好的活性和藥理作用[5-6],黃芩苷鋅在減輕氧化應、免疫調節和抗病毒方面的活性均優于黃芩苷[7-8]。武漢輕工大學獸用新藥的創制與評價科技創新團隊前期成功制備了黃芩苷鋅,發現其在體外具有較強的抑菌功能,急性經口毒性試驗評價為無毒級,口服給藥后仔豬體內無殘留,可作為一種安全的,有效的獸藥應用于仔豬腸道疾病的防治,該發現已申請專利并授權[9-10]。

現有文獻報道的黃芩苷鋅含量測定方法有EDTA滴定法[11],但此方法存在缺點:黃芩苷鋅的固有顏色是磚紅色,會干擾滴定終點的顏色判斷,此外黃芩苷鋅的溶解度很小,會影響滴定的準確性。課題組前期研究發現一定前處理條件下,黃芩苷鋅可分解成黃芩苷和鋅離子,考慮通過測定鋅或者黃芩苷的含量后換算成黃芩苷鋅的量。其中《中華人民共和國獸藥典(2020版)》中藥材黃芩中黃芩苷的含量測定方法為高效液相色譜法(HPLC),目前Zn2+檢測方法主要為原子吸收光譜法、分光光度法、離子色譜法等,其中精密度最高的是原子吸收光譜法[12]。上述方法所用試劑及反應原理各有不同,因此本研究參考相關文獻,采用HPLC和原子吸收光譜法測定黃芩苷鋅的含量,并比較測定結果。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和實驗材料

高效液相色譜儀(Waters-2489,美國Waters公司);紫外吸收檢測器(Waters-2487,美國Waters公司);自動進樣器(Waters-2707,美國Waters公司);高壓泵(Waters-1512,美國Waters公司);原子吸收光譜儀(Agilent 204DUO,美國Agilent公司);酸度pH計(E-301-D,上海儀電科學儀器股份有限公司);精密分析天平(BS-110S,北京塞多利斯儀器系統有限公司);純水儀(Millpore,德國Merck-Millipore公司);WatersX-Bridge C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)(Waters,美國Waters公司);迪馬Diamonsil C18色譜柱(150×4.6 mm,5 μm)(北京迪科馬科技有限公司);依利特Hypersil ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)(大連依利特分析儀器有限公司);原子吸收分光光度計(AAS-6000,江蘇天瑞儀器股份有限公司)。黃芩苷對照品(96.1 %,批號:Z0271910)購自中國獸醫藥品監察所;無水乙醇、甲醇、乙腈(均為色譜純)均購自國藥集團化學試劑有限公司;二甲基亞砜(分析級)購自國藥集團化學試劑有限公司;磷酸(分析級)購自天津市凱通化學試劑有限公司;鹽酸、硝酸均購自中國藥集團化學試劑有限公司;鋅標準溶液(1000 μg/mL)購自中國計量科學研究院。

1.2 高效液相色譜法

1.2.1 色譜條件 采用Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,流動相為乙腈-0.05 %磷酸水溶液(30∶70);流速1.0 mL/min;檢測波長278 nm;進樣量20 μL;柱溫:30 ℃。

1.2.2 溶液的配制 對照品溶液配制:精確稱取干燥的黃芩苷對照品約20 mg于100 mL容量瓶中,加流動相適量,超聲30 min待完全溶解后,冷卻定容至刻度,得到濃度約為200 μg/mL的對照品儲備溶液。同法制備供試品溶液。

1.3 原子吸收光譜法

1.3.1 測定方法 鋅元素儀器測定條件見表1。

表1 儀器工作條件Tab 1 The analytical condition of Zn element

按表2所列儀器工作條件,用原子吸收法測定樣品溶液中Zn的含量,測定時需將供試品液稀釋200倍后再測定。

表2 HPLC法加樣回收率測定結果Tab 2 Results of HPLC dosing recovery

鋅離子含量計算:

其中m1為原子吸收法測得的鋅離子含量(單位:μg/mL),m0為檢測所用的樣品重量(單位:g)。

1.3.2 溶液的配制 對照品溶液的配制:取1000 μg/mL的鋅標準溶液用1%的稀硝酸稀釋成10 μg/mL的標準儲備液,置于4 ℃保存,備用。

供試品溶液的配制:準確稱取0.1 g樣品于潔凈的坩堝中,炭化1 h待無煙冒出后,置馬弗爐內550 ℃灰化4 h。冷卻置室溫后,加入5 mL(6 mol/L)的鹽酸潤濕,再滴加5滴濃硝酸,在電熱爐上加熱至微沸約1 min,過濾后轉移到50 mL容量瓶中,然后用1%稀硝酸定容,搖勻,備用。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜法

2.1.1 專屬性試驗 取1.2.2項下制備的對照品溶液和供試品溶液各20 μL,注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖。圖1-3表明,供試品和對照品在該色譜條件下出峰時間吻合,峰型良好,說明該方法專屬性良好。

圖1 空白溶液色譜圖Fig 1 Chromatogram of blank solution

圖2 黃芩苷對照品溶液色譜圖Fig 2 Chromatogram of baicalin reference solution

圖3 供試品溶液色譜圖Fig 3 Chromatogram of the test solution

2.1.2 線性及范圍 精密量取1.2.2項下的對照品儲備溶液適量,加流動相稀釋成濃度為10、20、50、100和200 μg/mL的溶液,分別取20 μL注入高效液相色譜儀進行測定。以黃芩苷濃度為橫坐標(X),色譜峰面積為縱坐標(Y)進行回歸分析(圖4),得到回歸方程為y=76954x-24589,r=0.9999,說明黃芩苷在10.0～200.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

圖4 標準曲線Fig 4 Baicalin linear diagram

2.1.3 精密度試驗 精密量取1.2.2項下的對照品儲備溶液適量,加流動相稀釋成濃度為50 μg/mL的溶液,按“含量測定1.2.1”項下色譜條件測定。連續進樣6次,記錄色譜圖,色譜峰面積RSD(n=6)為0.08%,說明儀器精密度良好。

2.1.4 重復性試驗 取同一批黃芩苷鋅原料藥(批號1#),按1.2.2項下的方法制備供試品溶液共6份,進行平行測定,結果6次測定的平均含量為99.34%,RSD(n=6)為0.97 %,說明該方法重復性良好。

2.1.5 穩定性試驗 取同一供試品溶液,在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后進樣,記錄色譜峰面積,RSD(n=6)為0.94%,說明供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.6 準確度試驗 將供試品(批號1#,含量99.58%)稱樣量減半,共稱取6份,分別加入相當于供試品100%的黃芩苷對照品,配制成供試品溶液。按1.2.1的條件進行測定,計算加樣回收率,結果6份供試品加樣回收率為101.47%～102.28%,平均加樣回收率為101.83%,RSD(n=6)為0.33%。見表2。

2.1.7 方法耐用性考察 采用同一批黃芩苷鋅原料藥(批號1#),按1.2.1項下方法制備供試品溶液,分別使用X-Bridge C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)、Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)和Hypersil ODS(150 mm×4.6 mm,5 μm)測定,觀察色譜如圖5-7,三種色譜柱主峰拖尾因子均<2,說明該方法耐用性良好。

圖5 X-Bridge C18色譜圖Fig 5 X-Bridge C18 chromatogram

圖6 Diamonsil C18色譜圖Fig 6 Diamonsil C18 chromatogram

圖7 Hypersil ODS色譜圖Fig 7 Hypersil ODS chromatogram

2.2 原子吸收光譜法

2.2.1 線性及范圍 用1%的稀硝酸將對照品標準儲備液稀釋成0、0.5、1、1.5和2.0 μg/mL的標準工作溶液,注入原子分光光度儀,照1.4.1項下測定,根據吸光度值繪制標準曲線。得到回歸方程為y=0.3957x+0.1054,r=0.9983,說明鋅離子在0～2.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.2 重復性 取同一批黃芩苷鋅原料藥(批號1#),精密稱取6份,按2.2.1項下的方法制備供試品溶液共6份,進行平行測定,結果6次測定的平均含量為99.21 %,RSD(n=6)為0.13 %,說明該方法重復性良好。

2.3 兩種含量測定方法結果比較 取黃芩苷鋅原料藥(批號1#,2#和3#)用高效液相色譜法和原子吸收分光法進行測定,并將結果進行t檢分析,t測=1.300(P=0.263(>0.05)),結果表明兩種方法的測定結果無顯著性差異(α=0.05),見表3。

表3 兩種方法測定含量的結果Tab 3 Results of the two determination methods

3 討論與結論

原子吸收光譜法被廣泛運用于食品[13]和環境[14]中重金屬元素檢測、礦石[15]中金屬元素的檢測、藥物[16]中微量元素檢測,原子吸收光譜法可以檢測藥物中的金屬元素,也可以間接測定藥物中的有機成分。例如,張青雨[17]用四苯硼鈉全沉淀硫酸阿托品,在濾液中加入過量的氯化鉀沉淀剩余的四苯硼鈉,再用原子吸收光譜法測定過量的鉀可以計算得到硫酸阿托品的含量。關于黃芩苷含量測定的手段已經越來越成熟,主要包括薄層色譜法(TLC)、HPLC法和液相色譜-質譜聯用法(LC-MS/MS)等。在諸多含量測定方法中高效液相色譜最為常見,由于其操作簡便、準確性好且重復性高,被廣泛應用于黃芩苷的定量分析及質量控制研究[18]。

由表3結果顯示,HPLC和原子吸收光譜法的測定結果無顯著性差異,故兩種方法都可作為黃芩苷鋅含量測定的方法。原子吸收光譜法測定原理為黃芩苷鋅經過炭化和灰化后獲得游離的鋅原子,再通過原子吸收光譜儀測定鋅的含量后計算黃芩苷鋅的量。樣品前處理中要用到強酸和高溫,馬弗爐灰化耗時過長(一般需要4 h)。HPLC法測定的原理是在弱酸條件下,黃芩苷鋅會分解成黃芩苷,以黃芩苷為對照,測定出具體含量后計算出黃芩苷鋅的含量。該方法相較于原子光譜法前處理操作簡單、安全,重復性好,準確度高,結果穩定可靠,推廣性更好,因此,更適用于黃芩苷鋅及其制劑的質量控制。