湯笑語,張麗燕,邱文英,陳奕帆,馬明昊

(華派生物技術(集團)股份有限公司,成都 641423)

A型塞內卡病毒(Senecavirus A,SVA)是一種小RNA病毒科(Picornaviridae),塞內卡病毒屬(Senecavirus)的單股正鏈RNA病毒[1]。SVA能夠感染不同年齡段豬,引起豬的原發性水皰病,SVA感染的臨床癥狀與口蹄疫、水皰性口炎、豬水泡病相似,主要表現為豬鼻部、口唇部、蹄部出現水泡病變甚至潰爛,新生仔豬感染SVA還可能會導致死亡[2-3]。2015年廣東省首次報道豬感染SVA后,直至今日,SVA已在我國廣泛流行,但目前還沒有商品化疫苗用于該病的防控[4-7]。豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又稱藍耳病,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染引起的一種免疫抑制性疾病,該病傳染性強,發病率高,嚴重危害了養豬業的發展[8-10]。藍耳病的免疫抑制作用不僅會導致感染豬繼發其他細菌性疾病,加重病程,還會致使其它疫苗的免疫反應降低,導致免疫效果降低或免疫失敗[11-13]。已有研究表明多種疾病疫苗的免疫效果都會受到藍耳病的影響,如豬瘟、豬口蹄疫等[14-15]。本研究通過同時對PRRS陽性豬和PRRS陰性豬免疫塞內卡滅活苗,檢測其中和抗體效價及攻毒保護情況,探究PRRS是否會影響SVA滅活苗的免疫效果,為SVA和PRRSV的防控以及疫苗研發提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與病毒 豬塞內卡病毒(A/ZJ/2015株),由中國農業科學院蘭州獸醫研究所分離、鑒定,由華派生物技術(集團)股份有限公司鑒定、保管及供應。倉鼠腎細胞(BHK-21),由華派生物技術(集團)股份有限公司質管部保存。

1.1.2 主要試劑 SVA滅活疫苗由華派生物技術(集團)股份有限公司制備,MEM培養基、胰蛋白酶購自GIBCO;新生牛血清購自內蒙古金源康生物工程材料有限公司;高效率逆轉錄試劑盒購自東洋紡(上海)生物科技有限公司;2×Taq PCR預混試劑購自天根生化科技(北京)有限公司;PBS緩沖液由華派生物技術(集團)股份有限公司實驗室配制。

1.1.3 引物 PRRSV鑒定引物PRRSV-F/PRRSV-R及SVA鑒定引物SVA-F/SVA-R序列如表1所示,所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限合成,由華派生物技術(集團)股份有限公司保存。

表1 引物的序列Tab 1 Sequence of primers

1.2 方法

1.2.1 試驗動物的篩選 35～42日齡仔豬5頭,SVA抗原陰性、PRRSV抗原陽性,SVA抗體陰性(中和抗體效價小于1∶4);豬場半年內未免疫PRRSV活疫苗。35～42日齡仔豬10頭,SVA、PRRSV抗原陰性,SVA抗體陰性(中和抗體效價小于1∶4)。

1.2.2 試驗動物分組及免疫方案 如表2所示,A組為PRRS陽性組,B、C組為PRRS陰性組;A、B組免疫SVA滅活疫苗,每頭2.0 mL,C組為對照組,免疫相同體積生理鹽水,間隔2周后以同樣劑量加強免疫一次。

表2 動物分組及免疫方案Tab 2 Animal grouping and immunization program

1.2.3 SVA中和抗體效價檢測 采集試驗仔豬免疫后7 d、14 d、21 d、28 d的血液并分離血清,血清經56 ℃、30 min滅活后進行中和抗體效價測定。

將2倍系列稀釋的待檢血清加入96孔細胞培養板,每個血清樣品平行做4孔,50 μL/孔,之后每孔加50 μL含200 TCID50的SVA病毒液,置于37 ℃中和1 h;每孔加100 μL BHK-21細胞懸液(2×105/mL～3×105/mL),置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養,72～96 h判定結果。同時設陰、陽性血清對照,病毒對照和細胞對照;陰性血清與待檢血清同倍稀釋,陽性血清稀釋至32倍中和抗體效價。當病毒對照組及陰性血清對照組均出現細胞病變4/4孔,細胞對照組及陽性血清對照組均出現細胞病變0/4孔時,試驗成立。以能抑制50%以上細胞出現細胞病變的血清最高稀釋度的倒數判定為該血清抗體效價的滴度。

1.2.4 攻毒保護試驗 免疫后28 d,用SVA病毒液(A/ZJ/2015株,F10代)進行攻毒,頸部肌肉注射,4.0 mL/頭(108.8TCID50/mL)。試驗豬攻毒后10 d內四蹄中任一蹄或鼻鏡出現水皰或者潰瘍均判為發病,部分試驗豬可能伴有精神沉郁、食欲差等癥狀。試驗豬攻毒后10 d內四蹄、鼻鏡均未出現水皰或者潰瘍,精神、食欲正常,如出現精神沉郁、食欲差等臨床癥狀,應持續不超過2 d,即判為保護。

2 結果與分析

2.1 試驗動物的篩選 將初步篩選的仔豬采集全血,提核酸并反轉錄后采用SVA鑒定引物SVA-F/SVA-R及PRRS鑒定引物PRRSV-F/PRRSV-R對仔豬進行抗原檢測。如圖1所示,所有試驗豬SVA陰性,A組5頭試驗豬(泳道19-23)PRRSV全部陽性,其余全部PRRSV陰性,符合試驗要求。將A組陽性血清樣本PCR擴增測序后進行同源性分析,結果顯示A組試驗豬感染的PRRSV(將其命名為SC-PRRSV)與高致病性毒株GXNN1409、JXA1等親緣關系較近(圖2),判定A組PRRSV陽性豬為高致病性野毒感染。

M:Marker;1:SVA陰性對照;2-16:15頭試驗豬樣品SVA檢測;17:SVA陽性對照;18:PRRSV陰性對照;19-33:15頭試驗豬樣品PRRSV檢測;34:PRRSV陽性對照圖1 試驗動物篩選PCR鑒定結果Fig 1 PCR test result of experimental animal screening

圖2 SC-PRRSV系統發育進化樹分析Fig 2 Phylogenetic tree analysis of SC-PRRSV

2.2 血清中和抗體效價 檢測所有試驗豬免疫后7 d、14 d、21 d、28 d的血清中和抗體效價,結果如表3所示,PRRS陽性組(A組)及對照組(C組)仔豬免疫后血清中和抗體效價均<1∶4,而PRRS陰性組(B組)仔豬免疫后21 d開始出現較高效價,最高可達1∶512,免疫后28 d抗體水平較免疫后21 d開始下降,但大多數也維持在較高水平(1∶64～1∶256)。

表3 試驗豬血清中和抗體效價結果Tab 3 Result of pig serum neutralizing antibody titer

2.3 攻毒保護情況 免疫后28 d對所有試驗豬進行攻毒,連續10 d觀察試驗豬臨床癥狀。攻毒保護結果如表4所示,PRRS陽性組(A組)1頭仔豬攻毒后4 d蹄部開始出現水皰癥狀(圖3A),攻毒后6 d所有仔豬均發病;PRRS陰性組仔豬攻毒后連續10 d都未出現臨床癥狀(圖3B);對照組2頭仔豬攻毒后4 d蹄部開始出現水皰(圖3C),攻毒后6 d全部發病。

A:PRRS陽性組(A組);B:PRRS陰性組(B組);C:對照組(C組)圖3 SVA攻毒后蹄部病變圖Fig 3 Hoof lesion after SVA challenge

表4 試驗豬攻毒保護結果Tab 4 Result of protection against virus challenge

3 討 論

疫苗免疫作為豬場防控各種病毒感染的有效手段之一備受重視,然而免疫失敗的案例仍屢見不鮮。豬疫苗免疫失敗的原因除了一些常見因素如疫苗本身免疫原性差、免疫方式錯誤、母源抗體影響、飼養管理不科學外,PRRS等免疫抑制性疾病也是重要因素[16-17]。本試驗對PRRS陽性豬和PRRS陰性豬免疫了相同劑量的SVA滅活苗,分別于首次免疫后7 d、14 d及加強免疫后7 d、14 d采集血清檢測中和抗體效價,結果顯示免疫組5頭PRRS陽性豬所有血清均無中和抗體效價,而5頭PRRS陰性豬中有1頭在首次免后14 d就開始出現效價,加強免疫后所有健康豬抗體效價上升到較高水平,最高可達1∶512。攻毒保護結果與中和抗體效價結果呈正相關,PRRS陽性組及對照組5頭試驗豬全部發病,而PRRS陰性組試驗豬達到5/5保護。PRRS陰性組仔豬的中和抗體效價結果及攻毒保護結果表明了該SVA滅活苗有良好的免疫原性,能夠對SVA感染提供免疫保護。PRRS陽性組免疫與PRRS陰性組相同批次,相同劑量的塞內卡滅活苗時,所有試驗豬中和抗體效價均小于1∶4,并且不能產生免疫保護,表明PRRS影響了SVA的抗體應答。

本研究首次證明了PRRS會影響SVA滅活疫苗的免疫效果,有研究表明PRRS也會導致其它疫苗免疫效果的下降,如在陳鵬[14]等人2018年的研究中,證明了PRRS會導致商品化豬O型口蹄疫濃縮苗免疫合格率下降;在張艷娜[15]等人的研究中發現PRRS野毒感染會顯著降低豬瘟兔化弱毒疫苗的免疫效果。PRRS會降低其它疫苗的免疫效果對我們有很多啟示。首先,我們對于PRRS的日常監控不可松懈,當豬場存在病情或監測到抗原時,應當加強飼養管理,采取藥物等手段提高豬的免疫力后再進行疫苗免疫。其次,制定合理的免疫程序也至關重要,雖然有部分實驗表明同時免疫豬瘟疫苗與PRRSV活疫苗時,免疫效力不會產生影響,甚至還具有誘導快速、增強和持久免疫反應的優勢,但PRRSV活疫苗是否會對其他疫苗的免疫反應造成影響還不清楚[18-19]。最后,從疫苗的研發來看,這也對研制出安全有效、不影響其它疫苗免疫效果的PRRSV活疫苗提出了挑戰。