氟苯尼考可溶性粉含量測定的不確定度分析

翟宏旭,王曉晨,劉 艷

(遼寧國托檢測有限公司,遼寧大連 116000)

氟苯尼考(Florfenicol),又稱氟洛芬、氟甲砜霉素。作為一種獸醫專用的酰胺醇類抗菌藥物[1],具有高效、低毒、抗菌譜廣、體內吸收性好等特點,對大多數酰胺醇類藥物、土霉素等耐藥的菌株仍然敏感,且抗菌活性優于其他酰胺醇類藥物[2]。主要用于治療敏感細菌引起的豬、雞、魚的細菌性疾病及支原體感染,對呼吸系統感染和腸道感染的治療具有顯著效果,在獸醫臨床具有廣闊應用前景[3]。

質量安全和有效性是研發及評價一款獸藥產品的基本準則,而質量控制是保證產品安全有效的前提基礎。在獸藥檢驗中,含量測定是判斷獸藥質量是否合格及安全有效的主要依據,其檢測過程涉及的每一環節都會引起誤差產生,從而影響檢測結果的準確性[4]。能夠正確的表達含有誤差的檢測結果并對結果的可信度作出評價,可提高檢測結果及結論的準確性、科學性。試驗結果和誤差分析采用測量不確定度表示,可克服傳統誤差理論的弊端,更全面、科學地反映檢測結果可信度[5-6]。

測量不確定度是根據所獲信息,表征賦予被測量值分散性的非負參數,由若干分量組成,其大小說明賦予被測量的值的可信程度[7]。測量不確定度在檢測結果臨界值的判斷、檢測方法的確認和測量結果與國際接軌等方面具有重要意義。本試驗根據CNAS-GL06: 2006《化學分析中不確定度的評估指南》,參考其他相關規定,查閱文獻,對氟苯尼考可溶性粉含量測定(HPLC法)的不確定度進行分析評價,探討其在獸用藥品質量檢驗中的應用,提高檢驗結論的準確性和科學性[8-10]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(LC-40);電子天平(FA2004);100 mL單標線容量瓶(A級);50 mL單標線容量瓶(A級);10 mL單標線容量瓶(A級);5 mL單標線移液管(A級)。

乙腈(色譜純,歐普森色譜試劑);冰醋酸(天津市大茂化學試劑廠);水(一級水);氟苯尼考對照品(99.1%,批號:K0301703,中國獸醫藥品監察所),氟苯尼考可溶性粉(山東魯抗舍里樂藥業有限公司,規格30%)。

1.2 色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;檢測器:紫外檢測器;檢測波長:224 nm;流動相:乙腈-水-冰醋酸(100∶197∶3);流速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL。

1.3 溶液配制 對照品溶液:稱取10 mg氟苯尼考對照品,置于100 mL容量瓶,加入適量的流動相使其溶解,定容至刻度,搖勻,制得濃度為100 μg/mL的標準貯備液。精密量取5 mL標準貯備液,置于10 mL容量瓶,加流動相定量稀釋至刻度,制成每1 mL中約含氟苯尼考50 μg的標準使用液。

供試品溶液:稱取適量氟苯尼考可溶性粉(約相當于氟苯尼考25 mg),置于50 mL容量瓶,加入適量流動相使其溶解,定容至刻度,搖勻,經0.22 μm濾膜過濾;精密量取5 mL續濾液,置于50 mL容量瓶,加流動相定量稀釋至刻度,制成每1 mL中約含氟苯尼考50 μg的供試品溶液。

P:供試品中氟苯尼考含量占標示量的比(%);AX:供試品溶液中氟苯尼考的峰面積(μV.s);AR:對照品溶液中氟苯尼考的照品峰面積(μV.s);WR:稱取對照品的質量(g);WX:稱取供試品的質量(g);PR:對照品純度(99.1%);fR:對照品稀釋倍數;fX:試品稀釋倍數;S:標示量(供試品規格:30%)。

1.5 測定步驟 按照上述色譜條件,設置儀器參數,對供試品溶液和對照品溶液進行分析,外標法定量,根據公式計算氟苯尼考含量占標示量的比(圖1)。

圖1 氟苯尼考可溶性粉含量測定步驟Fig 1 The content determination steps of Florfenicol Soluble Powder

2 結果與分析

2.1 測量不確定度的來源分析 試驗過程的每一環節如所用的試劑、對照品、稱量、定容、人員操作、儀器設備、環境等均可引入不確定度。

根據試驗測定步驟,結合數學模型,分析得出本試驗測定過程中的不確定度來源:對照品純度引起的不確定度(PR);對照品、供試品稱量過程引起的不確定度(W);對照品、供試品溶液稀釋倍數引起的不確定度(f);對照品、供試品峰面積測定過程引起的不確定度(A)。供試品規格S(30%)為標識量,無需考慮其不確定度(圖2)。

圖2 不確定度來源分析Fig 2 Analysis of uncertainty sources

2.2 不確定度分量的量化

2.2.2 稱量過程引入的測量不確定度 稱量過程采用減重法,稱量對照品16.5 mg,供試品101.5 mg。因對照品與供試品使用同一天平稱量,天平稱量范圍內產生的系統漂移可相互抵消,由天平靈敏度引起的不確定度忽略不計,其標準不確定度由天平校準誤差和稱量的重復性引起。

對照品稱量的相對標準不確定度為:

供試品稱量的相對標準不確定度為:

2.2.3 稀釋倍數引入的測量不確定度 稀釋倍數的測量不確定度主要來源于溶液配制、稀釋過程中使用的單標線移液管、單標線容量瓶的不確定度,其標準不確定度由玻璃量具校準、重復讀數及溫度體積偏差的不確定度引起。

在溶液配制及稀釋過程中使用到的玻璃量具有100、50、10 mL單標線容量瓶,5 mL單標線移液管。

容量瓶定容及移液管移取時,因體積讀數引入的不確定度可根據重復性試驗結果進行評價。重復測定溶劑定容至刻度線后容量瓶的重量,根據質量密度公式,得出重復測定的體積結果。在試驗操作中,容量瓶會蓋上磨口瓶塞稱重,故與操作人員對刻度讀數判斷產生的誤差相比,溶劑揮發性影響產生的誤差可忽略不計。溶液配制、稀釋所需溶劑組成多樣,故用水代替溶劑,同一個容量瓶經水定容至刻度或經5 mL移液管移取后稱重,測定10次重復,按照水的密度為1.0 g/mL計算體積。測定結果如表1、表2所示。

表1 容量瓶重復量取測定結果(n=10)Tab 1 The results of repeated measuring of volumetric flask (n=10)

表2 5 mL移液管重復量取測定結果(n=10)Tab 2 The results of repeated measuring of 5 mL pipette (n=10)

讀數重復性根據A類不確定度評定方法進行評價,標準偏差可直接用作標準不確定度。

溫度體積偏差的不確定度按照B類不確定度進行評定。乙腈的體積膨脹系數為1.37×10-3,水的體積膨脹系數為2.08×10-4,冰醋酸的體積膨脹系數為1.10×10-3。按照流動相條件乙腈-水-冰醋酸=100∶197∶3進行計算,20 ℃時,流動相的體積膨脹系數為6.04×10-4。

根據溶液配制及稀釋過程中玻璃量具的使用情況,對照品及供試品溶液因5 ml單標線移液管溫度引起的體積偏差可抵消,故由此引入的不確定度忽略不計。

將上述分量進行合成得100 mL容量瓶的標準不確定度為:

50 mL容量瓶的標準不確定度為:

10 mL容量瓶的標準不確定度為:

5 mL移液管的標準不確定度為:

對照品稀釋倍數的相對標準不確定度為:

供試品稀釋倍數的相對標準不確定度為:

2.2.4 峰面積測定過程引入的測量不確定度 峰面積測定的不確定度來源主要有儀器穩定性(泵流速、檢測器響應等)、進樣重復性、分離重復性等。含量測定試驗中被檢測濃度遠遠高于檢測限,因此峰面積測定過程中只考慮由重復性引起的不確定度,忽略由儀器等其他因素引入的不確定度,屬于A類不確定度。

分別取對照品和供試品溶液,依據1.2中色譜條件,連續進樣10次,測定峰面積,應用貝塞爾公式法計算,以峰面積標準偏差表示峰面積測定重復性標準不確定度。

峰面積測定的相對標準不確定度為:

2.2.5 計算合成標準不確定度 合成標準不確定度Uc是由測量模型中各輸入量的測量標準不確定度獲得的輸出量的測量標準不確定度,該值是將所有測量不確定度分量合成為總體方差的正平方根。將上述所有不確定度分量匯總,具體信息見表3。

表3 不確定度分量表Tab 3 Component Table of Uncertainty

對各個分量的相對標準不確定度進行合成,得到氟苯尼考可溶性粉含量測定合成相對標準不確定度:

=1.19×10-2。

根據計算公式,測得氟苯尼考可溶性粉中氟苯尼考含量為:

=97.3%。故氟苯尼考可溶性粉含量測定合成標準不確定度為:

uc=urc×P(標示量%)=0.0119×97.3%=1.16%。

2.2.6 擴展不確定度與測量不確定度報告 擴展不確定度分為U和Up兩種。在給出測量結果時,一般報告擴展不確定度U,U為合成標準不確定度Uc與包含因子k的乘積,通常測量中包含因子k取2,對應的置信概率為95%。

氟苯尼考可溶性粉含量測定的擴展不確定度為:U=uc×k=0.0116×2=0.0232,測量結果使用測定值±擴展不確定度來表示[13]。故氟苯尼考可溶性粉含量測定結果最終可表示為:P=(97.3±2.32)%,k=2。

3 討 論

通過評定測量過程中的不確定度,掌握測量過程中影響結果準確度的關鍵因素,可以為檢測方法及檢測結果的準確性、可靠性提供參考。引入測量不確定度后,檢測結果不再是單一的數值,而是被測值可能分布的區間范圍,以“檢測值±擴展不確定度(U) ”來表示。若該值在限值內,則檢測結果判定為合格;若不在限值內,則判定為不合格;若橫跨在限值兩側,則判定存在不確定性,具有一定風險,可選擇更有經驗的檢驗人員重復檢驗,確保檢測結果的準確性。對反復驗證后,“檢測值±U”仍橫跨在限值兩側,可在判定為符合規定的同時給出風險提示[14-15]。

本試驗根據《中華人民共和國獸藥典》2020年版一部,采用高效液相色譜法測定氟苯尼考可溶性粉中氟苯尼考的含量。根據CNAS-GL06:2006《化學分析中不確定度的評估指南》及相關規定,并參考相關文獻,對高效液相色譜法測定氟苯尼考可溶性粉含量的不確定度進行評價。根據不確定度評定結果可知,HPLC法測定氟苯尼考可溶性粉含量不確定度主要來源于對照品純度及稱量、稀釋、峰面積測定三個過程,其中對照品的稱量及對照品、供試品稀釋過程對測量不確定度的貢獻較大。為進一步提高檢驗結果的準確性,應該重點控制這幾個環節中的不確定度來源。

對照品的稱取量極小,屬于毫克級,該過程存在較大的誤差,為減小稱量引入的不確定度,可根據精度和量程范圍選擇適宜的天平,在允許范圍內,盡可能多的稱取,以減少不確定度的引入。溶液配制過程中,玻璃器具中量器的體積越小引入的不確定度越大,稀釋頻次越多引入的不確定度越大,因此我們可使試驗溫度接近玻璃器具校準溫度、選用A 級大容量器具來減少誤差,以減少此過程不確定度。除此之外,峰面積測定過程中使用自動進樣,為減少重復進樣引起的不確定度,我們應增加對液相色譜儀的日常保養,以確保儀器良好的工作狀態。試驗環境、人員等方面的因素,均可通過規范的操作及環境監控等有效措施來減少誤差的產生。

不確定度評定可為評估測定結果的可信度、規定質量控制范圍提供科學依據,是一份完整藥品檢驗報告書不可或缺的內容。本試驗為高效液相色譜法測定氟苯尼考可溶性粉含量不確定度的評價提供了可靠方法,并為類似產品的質控、含量測定結果的準確性提供了參考。