牛支原體NM001株單克隆抗體的制備與鑒定

劉 瑩,王靜文,張 敏,陳小云,王 磊,楊承槐

(中國獸醫藥品監察所(農業農村部獸藥評審中心),北京 100081)

牛支原體(Mycoplasmabovis,M.bovis)是一種能引起牛的肺炎、關節炎、結膜炎以及乳腺炎等多種疾病的微生物[1]。由于其沒有細胞壁,對常規的抗菌藥物青霉素不敏感,且對其他的抗菌藥物易產生耐藥性,導致感染后很難治療[2-3],嚴重危害養牛業的健康發展[4]。我國自2008年分離到牛支原體證實該病原存在以來[5-6],全國多個地區均有報道,且已給我國的養牛業造成了重大的經濟損失[7]。近期我國牛支原體血清流行病學調查結果顯示,我國云南省內牛血清樣本的牛支原體抗體陽性率可達到36.32%[8],說明我國牛支原體的診斷和防控急需加強。

目前,分離培養仍然是支原體最傳統的鑒定和診斷方法,但該方法耗時長且敏感度很低。梁月梅等人的研究結果表明,支原體分離培養的敏感度僅為PCR檢測方法的1/9.5,說明聚合酶鏈式反應的診斷更高效,特異性和敏感性更強[9]。熒光PCR(探針法)方法的應用使牛支原體檢測的敏感度進一步提高,但是上述檢測方法需要特殊的儀器設備,不易在基層的養殖場使用[10]。可視化環介導等溫擴增法可在一定的程度上克服上述檢測方法的難題,但該方法容易因環境污染出現假陽性[11-12],急需建立快速和準確的診斷方法來預防和控制牛支原體,而基于特異性高的單克隆抗體的抗原檢測方法的建立是一種重要的解決方案。本研究利用前期分離獲得的牛支原體內蒙分離株NM001[13]作為免疫原并結合無乳支原體等病原來篩選和制備牛支原體單克隆抗體,從而為后期牛支原體快速、準確診斷方法的建立提供物質基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 SP2/0骨髓瘤細胞株、牛支原體NM001株均為本實驗室保存;支原體EZH液體培養基為本實驗室制備;SPF級雌性6周齡BALB/c小鼠、經產BALB/c雌鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司;蛋白Marker、Western Blot Marker,均購自南京金斯瑞生物科技有限公司;MEM培養液購自Gibco公司;馬血清購自Gibco公司;胎牛血清購自PAN公司;聚乙二醇(PEG 1450)、弗氏佐劑、HAT和HT選擇性培養基均購自Sigma公司;Mab亞類鑒定試劑盒均購自于北京博奧龍公司;HRP 標記的羊抗鼠IgG購自寶生物工程(大連)有限公司;細胞培養板、細胞培養瓶均購自Corstar公司。

1.2 免疫原的制備 牛支原體NM001株在1000 mL EZH培養基37 ℃培養72 h后,取適量作計數用,剩余用終濃度為0.4%的甲醛滅活48 h,9000 r/min離心45 min收集菌體,再用滅菌PBS洗滌5次,用BCA試劑盒測定總蛋白濃度,于-80 ℃凍存。

1.3 動物免疫 以牛支原體NM001株滅活菌體用等體積弗氏佐劑乳化,皮下多點注射免疫5只雌性BALB/c小鼠,每只小鼠每次免疫抗原劑量為100 μg。每隔14 d免疫1次,三免后7～10 d,眼眶采血適量,用間接ELISA 法測定血清效價,若血清效價達到融合要求(效價高于12800),則在融合前三天加強免疫,直接用菌體蛋白腹腔注射,劑量為50 μg/只。免疫程序如表1。

表1 小鼠的免疫程序Tab 1 The vaccination strategy of mice

1.4 細胞融合 取免疫小鼠脾細胞與SP2/0細胞(10∶1)在PEG1450的作用下融合。具體方法:取50 mL離心管將細胞混合離心,棄上清,加入1 mL 37 ℃預熱的PEG1450,輕輕旋動離心管,緩慢加入10 mL無血清DMEM培養基,離心后棄上清;用含20%胎牛血清的HAT培養基重懸細胞,鋪布在含有飼養細胞的96孔細胞培養板中,細胞培養板放入培養箱中培養。

1.5 雜交瘤細胞的篩選 篩選用間接ELISA,所用包被抗原的制備方法是:分別收集牛支原體培養物、無乳支原體培養物、山羊支原體山羊肺炎亞種培養物,反復凍融8次后超聲波破碎,用BCA試劑盒測定蛋白濃度,分裝保存于-20 ℃,包被濃度經滴定確定為2 μg/mL。采用間接ELISA法篩選與牛支原體反應陽性、與無乳支原體反應陰性、與山羊支原體山羊肺炎亞種反應陰性的雜交瘤細胞,有限稀釋法分別亞克隆、建株、擴大培養,并置于液氮中長期保存。

1.6 雜交瘤細胞分泌抗體的亞型鑒定 按照北京博奧龍公司單抗亞型鑒定試劑盒所附帶的說明書操作流程,用2株雜交瘤細胞培養上清分別檢測單抗亞型。

1.7 牛支原體單抗腹水的制備與純化 選取經產的健康BALB/c小鼠,腹腔注入0.5 mL弗氏不完全佐劑。10 d后再向小鼠腹腔內注射雜交瘤細胞,每只小鼠注射約106個細胞。當小鼠腹圍明顯膨大,行動不便時,無菌抽取腹水。選用Protein A (GE Healthcare 17-5079-01)親和柱純化方法進行純化。

1.8 單抗特異性分析

1.8.1 單抗間接ELISA效價的測定 用PBS做稀釋液,雜交瘤細胞培養上清、純化后的腹水從1∶10開始做倍比稀釋,按上述建立的牛支原體間接ELISA方法測定效價,測定OD450 nm后以陽性值/陰性值>2.1的最大稀釋度為樣品抗體效價。

1.8.2 ELISA檢測單抗特異性 將無乳支原體、山羊支原體山羊肺炎亞種、絲狀支原體山羊亞種、綿羊肺炎支原體、牛巴氏桿菌的全菌蛋白以及馬血清按照1.5項方法處理,包被ELISA板,2 μg/mL,以間接ELISA方法測定各株單抗的特異性。

1.8.3 Western Blot鑒定單克隆抗體反應性 將牛支原體和馬血清進行SDS-PAGE電泳并轉印(50 V,2 h)至PVDF膜上,5%脫脂奶封閉90 min。用不同種類的純化后單克隆抗體(1∶1000稀釋)與不同的牛支原體泳道分別孵育(37 ℃,1 h), 用單克隆抗體的等量混合物(最終稀釋度為1∶1000)與馬血清泳道在相同條件下反應,PBST洗滌后,與 HRP-羊抗鼠IgG(1∶5000稀釋)室溫作用0.5 h,洗滌后,化學發光檢測儀檢測。

2 結 果

2.1 免疫原的制備 通過培養、滅活、洗滌,獲得濃度為1.2 mg/mL的牛支原體NM001株,SDS-PAGE鑒定結果如圖1所示。

M: 蛋白Marker; NM001: 牛支原體分離株NM001M: protein Marker; NM001: The strain of Mycoplasma bovis NM001圖1 牛支原體分離株NM001的SDS-PAGE鑒定Fig 1 The identification of the strain of Mycoplasma bovis NM001 by SDS-PAGE

2.2 雜交瘤細胞的篩選和分泌抗體的亞型鑒定 細胞融合后,經間接ELISA篩選出與牛支原體反應陽性、與無乳支原體和山羊支原體山羊肺炎亞種反應陰性的雜交瘤細胞陽性克隆,經過3次亞克隆后,得到兩株能穩定分泌抗牛支原體單克隆抗體的雜交瘤細胞株,分別為2C5和7G3,雜交瘤細胞上清的間接ELISA效價可達6.4×103和1.2×104。如表2所示,抗體亞型鑒定結果表明,2株分泌的單克隆抗體均屬于IgG1亞型,輕鏈均是λ型。

表2 單克隆抗體亞型的鑒定Tab 2 Identification of antibody isotyping to monoclonal antibodies

2.3 單克隆抗體2C5和7G3的制備與純化 利用經產小鼠制備雜交瘤細胞株2C5和7G3的腹水,將收集到的腹水用Protein A(GE Healthcare 17-5079-01)親和柱純化方法進行純化,結果如圖2所示,獲得純度較高的單克隆抗體2C5和7G3,其濃度可達2.1 mg/mL和3.2 mg/mL。

M: 蛋白Marker; 1: 單克隆抗體2C5;2: 單克隆抗體7G3M: protein Marker; 1: Monoclonal antibody 2C5; 2: Monoclonal antibody 7G3圖2 單克隆抗體的純化Fig 2 Purification of 2C5 and 7G3

2.4 單克隆抗體2C5和7G3的鑒定

2.4.1 單克隆抗體2C5和7G3的間接ELISA效價測定 選用牛支原體作為包被抗原建立的間接ELISA方法對單克隆抗體2C5和7G3進行效價測定,結果顯示單克隆抗體2C5和7G3的效價可達1.02×105和4.09×105,工作濃度分別為2.06×10-5mg/mL和7.82×10-6mg/mL。

2.4.2 單克隆抗體2C5和7G3的特異性檢測 如表3所示,間接ELISA結果表明,2C5和7G3與無乳支原體、山羊支原體山羊肺炎亞種、絲狀支原體山羊亞種、綿羊肺炎支原體、牛巴氏桿菌以及馬血清均不反應。

表3 單克隆抗體特異性鑒定Tab 3 Specific identification of monoclonal antibodies

2.4.3 單克隆抗體2C5和7G3與牛支原體反應的Western Blot鑒定 Western Blot結果表明,單克隆抗體2C5和7G3均能與牛支原體全菌蛋白發生反應,且兩株單抗識別的蛋白大小相近,均在60 kD左右,而兩株單抗均不與馬血清發生反應。

3 討 論

單克隆抗體的制備是建立優良抗原檢測方法的基礎,而免疫原的選擇是單克隆抗體制備的關鍵。雖然研究者通過基因組學以及蛋白組學分析技術已經鑒定出了許多相對保守的抗原蛋白(如P26、P48、P81、HSP60、α-烯醇化酶、GAPDH、EF-Ts、MilA以及TrmFO等)[14],但很多蛋白的免疫保護作用(如Vsps、PMB67以及GAPDH)[15-16]未得到確認,導致單一的蛋白很難作為免疫原來制備牛支原體的單克隆抗體。為了制備出優良的抗牛支原體單克隆抗體,選擇以牛支原體全菌體作為免疫原。為了保證滅活徹底且免疫原性不被破壞,選擇終濃度為0.4%的甲醛滅活48 h。

M. 蛋白Marker;1. 2C5與牛支原體的反應;2. 7G3與牛支原體的反應;3. 2C5和7G3等量混合物與馬血清的反應M: Protein Marker; 1: The interaction of Mycoplasma bovis with 2C5; 2: The interaction of Mycoplasma bovis with 7G3; 3: The interaction of horse serum with mixture of 2C5 and 7G3圖3 2C5和7G3與牛支原體反應的Western Blot 鑒定Fig 3 The identification of Mycoplasma bovis with 2C5 and 7G3 by Western Blot

已有的研究表明牛支原體和無乳支原體PG2同源性很高[17-18],以牛支原體為免疫原制備的單抗,易產生與無乳支原體發生交叉反應的克隆株。任澤民等以牛支原體全菌體制備的6株單克隆均能夠與無乳支原體發生交叉反應[19]。為此,本研究在雜交瘤細胞株的篩選階段,用牛支原體包被ELISA板做陽性篩選,用無乳支原體、山羊支原體山羊肺炎亞種包被ELISA板做陰性篩選,從源頭淘汰發生交叉反應的克隆株,從而保證篩到特異性高的牛支原體單抗。此外,為了排除馬血清對單克隆抗體篩選的干擾,本研究采用滅菌PBS將滅活后的牛支原體洗滌了5次,同時通過ELISA和Western Blot方法證實了單克隆抗體與馬血清無反應性。

ELISA和Western Blot結果均表明本研究制備的兩株單克隆抗體與牛支原體能夠發生很好的特異性結合,但兩株單抗針對的抗原表位還未知。本研究前期分別通過原核表達系統獲得了3種常見的重組牛支原體蛋白,但均未能與獲得的兩株單抗發生特異性的反應,這可能是由于牛支原體抗原復雜,未獲得單克隆抗體的靶標蛋白,或者是由于原核表達的重組蛋白喪失了單克隆抗體針對的天然表位。上述獲得的牛支原體單克隆抗體一方面可與滅活的支原體結合,建立牛支原體抗體阻斷ELISA方法;另一方面可將獲得的單克隆抗體作為包被抗原建立用于雙抗夾心檢測牛支原體病原。為了將抗牛支原體單克隆抗體更好地運用到牛支原體的抗原/抗體血清學檢測以及牛支原體NM001株的致病性研究,后期需要投入更多的研究來分析獲得這兩株特異性單克隆抗體針對的抗原表位信息。