燈盞花乙素增強(qiáng)4T1 乳腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的體內(nèi)外研究

張 琦，包小波，田沖沖

（江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇鹽城 224005）

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤[1]。三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）及人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）均為陰性的一種特殊乳腺癌亞型，約占乳腺癌總數(shù)的15%[2]。TNBC 是乳腺癌治療中最棘手一種，具有發(fā)病年齡早、惡性程度高、侵襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高、易發(fā)生肝腦器官轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)[3]。TNBC 患者的預(yù)后較差，如果患者在確診時(shí)沒有發(fā)生轉(zhuǎn)移，其5 年生存率可達(dá)65%～90%，但不幸的是，有約46%的患者會(huì)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的中位生存期僅為13.3 個(gè)月[4-5]。由于其特殊的分子表型，TNBC 對(duì)內(nèi)分泌治療和分子靶向治療均不敏感，化療仍然是TNBC 的主要的系統(tǒng)治療手段，但化療效果卻不盡如人意[6-7]。順鉑（cisplatin，CDDP）是治療TNBC 的重要化療藥物。作為一種鉑類烷化劑，CDDP 通過與細(xì)胞的 DNA 結(jié)合，形成鏈內(nèi)或鏈間交聯(lián)，導(dǎo)致 DNA 雙鏈斷裂損傷，達(dá)到抗腫瘤作用[8]。雖然 CDDP 對(duì)TNBC 的治療具有較好的療效[9-11]，但是隨著治療時(shí)間延長，TNBC 會(huì)對(duì)CDDP 產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致疾病的進(jìn)一步發(fā)展和預(yù)后不良[12]。因此，提高機(jī)體對(duì) CDDP的化療敏感性對(duì)TNBC 的臨床治療具有重大意義。

燈盞花是中國傳統(tǒng)中藥材之一，除具備藥用價(jià)值以外，其還被開發(fā)應(yīng)用于食品如飲茶及化妝品領(lǐng)域[13-15]。燈盞花乙素（scutellarin，SCU）是從燈盞花中提取的一種黃酮苷[16]。研究指出，SCU 具有重要而廣泛的藥理活性，包括抗炎[17]、抗氧化[18]、抗纖維化[19]、抗凋亡[20]和抗腫瘤[21-22]等生物活性。此外，SCU 還有一定的化療增敏作用。比如姚俠等[23]的研究表明SCU 能通過下調(diào)三結(jié)構(gòu)域蛋白（tripartite motif-containing protein 32，TRIM32）的表達(dá)增強(qiáng)卡鉑的抗卵巢癌活性。Gao 等[24]也證實(shí)SCU 能夠以劑量依賴的方式增加前列腺癌細(xì)胞對(duì)CDDP 的敏感性。但關(guān)于SCU 聯(lián)合CDDP 在TNBC 治療方面，目前尚無報(bào)道。

因此，本研究采用乳腺癌細(xì)胞4T1 為研究對(duì)象，體外探究SCU 聯(lián)合CDDP 對(duì)4T1 的直接作用，并且建立4T1 荷瘤小鼠模型，體內(nèi)觀察兩者聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤生長的影響，從而探討聯(lián)合治療抑制乳腺癌發(fā)生與發(fā)展的作用機(jī)制，為TNBC 的治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雌性BALB/c 小鼠24 只（體重16±2 g）江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司提供（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（蘇）2020-0009）。飼養(yǎng)于江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院SPF 級(jí)動(dòng)物房（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（蘇）2018-0008）。飼養(yǎng)條件：溫度24.0±1.0 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，晝夜交替進(jìn)行光照，自由飲水和進(jìn)食。所有操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)要求和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例，本實(shí)驗(yàn)已通過江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)2020011）；4T1 細(xì)胞株 中科院上海細(xì)胞庫；胎牛血清、RPMI-1640 培養(yǎng)基 美國Gibco 公司；0.25%胰酶（1:250）Biosharp 生物科技公司；燈盞花乙素粉末 昆明龍津藥業(yè)有限公司；順鉑 齊魯制藥（海南）有限公司；Martrigel 基質(zhì)膠、Transwell 小室 Corning 公司；烏拉坦 上海山浦化工有限公司；肝素鈉注射液 上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司；多聚甲醛 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；Annexin V 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、PCR 引物 博士德生物工程有限公司；蘇木素-伊紅（H&E）染色液Solarbio 公司；總RNA 提取試劑Trizol、RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 試劑盒 Thermofisher 公司；PCR 試劑盒 Roche 公司；β-actin 抗體、Caspase-3 抗體、Bax 抗 體、Caspase-9 抗 體、Cleaved-Caspase-3 抗體、Cleaved-Caspase-9 抗體、Bcl-2 抗體 Abcam公司。

HF90 細(xì)胞培養(yǎng)箱 上海力申儀器有限公司；醫(yī)用超凈工作臺(tái) 江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司；XD-202 倒置顯微鏡 德國ZEISS 公司；游標(biāo)卡尺 世達(dá)工具有限公司；ELX808 酶標(biāo)儀 美國BIOTEK 公司；TS-1000 脫色搖床 其林貝爾儀器制造有限公司；YB5001B 電子太平 上海衡際科學(xué)儀器有限公司；DY89-II 電動(dòng)玻璃勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 4T1 細(xì)胞培養(yǎng) 將4T1 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%的胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用0.25%胰酶常規(guī)消化細(xì)胞并傳代。

1.2.2 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 參考Cao 等[25]的方法，取對(duì)數(shù)生長期的4T1 細(xì)胞以8×103個(gè)/孔的密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，分別加入不同濃度梯度的藥物：CDDP（0、10、20、40、80 μmol/L）、SCU（0、25、50、100、200 μmol/L）以及聯(lián)合用藥組CDDP+SCU（80 μmol/L+200 μmol/L）；同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（無4T1 細(xì)胞），每組6 個(gè)復(fù)孔。48 h 后，向每孔中添加CCK-8 溶液10 μL，孵育2 h。使用酶標(biāo)儀測定450 nm 處的光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。上述實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3 次。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的遷移能力 參照張媛等[26]的方法，取對(duì)數(shù)生長期的4T1 細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞生長密度達(dá)80%左右時(shí)用100 μL槍頭在孔中劃一條直線，PBS 沖洗后，分別加入2 mL 不含血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基與CDDP（80 μmol/L）組、SCU（200 μmol/L）組、聯(lián)合用藥組（CDDP+SCU）培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h 后拍照，實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3 次。

1.2.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力 參考張媛等[26]的實(shí)驗(yàn)方法并進(jìn)行修改。將Transwell 小室放入24 孔板中，在小室的上室中加入50 μL Martrigel基質(zhì)膠，置于37 ℃培養(yǎng)箱中5 h，待Martrigel 基質(zhì)膠凝固后，將收集到的4T1 細(xì)胞用無血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按2×105個(gè)/孔的密度接種至Transwell 上室中，并加入含200 μL 無血清培養(yǎng)基。下室加入600 μL 用完全培養(yǎng)基配制的不同濃度藥物溶液（80 μmol/L CDDP，200 μmol/L SCU，CDDP+SCU），于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。取出上室，經(jīng)無水酒精固定后，結(jié)晶紫染色，雙蒸水沖洗后于顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)相同密度細(xì)胞的視野進(jìn)行觀察拍照，觀察并計(jì)算各組細(xì)胞穿出膜的數(shù)量。每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3 次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 使用流式細(xì)胞術(shù)檢測SCU 聯(lián)合CDDP 對(duì)4T1 細(xì)胞凋亡的影響。收集對(duì)數(shù)生長期的4T1 細(xì)胞，0.25%胰酶常規(guī)消化，1000 r/min 離心5 min 去除上清，接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后使細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右，分別加入不同濃度的藥物溶液進(jìn)行干預(yù)。24 h 后分別收集CDDP（80 μmol/L）組、SCU（200 μmol/L）組、聯(lián)合用藥組（CDDP+SCU）處理過的4T1 細(xì)胞，4 ℃，1500×g，5 min 離心去上清。加入預(yù)冷的PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞，4 ℃，1500×g，5 min 離心去上清，重復(fù)2 次。利用雙蒸水稀釋5×Binding Buffer 為1×Binding Buffer，每管加入500 μL 的1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞。每管加入5 μL 的異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyanate，F(xiàn)ITC）及10 μL 的碘化丙啶（Propidium Iodide，PI），輕柔混勻，室溫避光孵育10 min。最后，每管加入400 μL 的PBS 緩沖液稀釋細(xì)胞，并于1 h內(nèi)進(jìn)行檢測。

1.2.6 荷瘤小鼠模型的建立 參考Pulaski 等[27]的方法建立4T1 荷瘤小鼠模型，即4T1 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，用RPMI-1640 培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL，接種于BALB/c 小鼠股溝皮下，每只0.1 mL（1×106個(gè)細(xì)胞）。

1.2.7 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 BALB/c 小鼠皮下注射接種4T1 細(xì)胞后，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定給藥濃度，并隨機(jī)分為4 組，每組6 只：對(duì)照組（生理鹽水）、60 mg/kg SCU 組、3.0 mg/kg CDDP 組和SCU+CDDP 組，接種后第7 d 腫瘤開始長出，按上述分組腹腔注射相應(yīng)劑量的藥物，之后每24 h 腹腔給藥一次，共給藥11 次。

1.2.8 小鼠稱重以及采集腫瘤組織樣本 小鼠每天稱重；待小鼠體內(nèi)腫瘤長出后，用游標(biāo)卡尺每隔1 d 測量腫瘤長徑（a）與短徑（b），記錄并計(jì)算小鼠腫瘤體積（V=1/2ab2）。待小鼠腫瘤最大直徑約為10 mm 時(shí)，20%（w/v）烏拉坦腹腔注射麻醉小鼠，用1 mL 注射器抽取腹腔靜脈血，剝離腫瘤組織，稱重并拍照，將腫瘤組織投入到預(yù)先配好的4%（w/v）多聚甲醛中固定。

1.2.9 腫瘤組織病理染色 將腫瘤組織固定在4%多聚甲醛中，將固定的腫瘤組織在分級(jí)乙醇溶液中脫水，二甲苯透明，浸入石蠟，包埋制成蠟塊。將組織蠟塊切成約5 μm 厚的組織切片，用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素浸泡3 min，1%鹽酸乙醇分化，0.6%氨水返藍(lán)，純水洗滌。滴加伊紅染液約3 min，在95%乙醇中梯度脫水，二甲苯清洗10 min，中性樹膠封片。置于光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像。用Image-Pro Plus 軟件分析染色圖片，計(jì)算各組腫瘤組織中的微血管密度（microvascular area，MVA）。

1.2.10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測腫瘤組織中凋亡因子轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá) Trizol 分離提取腫瘤組織中總的RNA，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)在20 μL 體系中進(jìn)行，反應(yīng)體系：1 μL qPCR 引物，1 μL cDNA產(chǎn)物，10 μL SYBR Green qPCRMaster Mix（2×）。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循環(huán)40 次。溶解曲線60～95 ℃，每15 s 升溫0.3 ℃。以GAPDH 為內(nèi)參基因，通過目的基因定量拷貝數(shù)=2-△△CT方法分析數(shù)據(jù)。基因引物序列見表1。

表1 本研究中使用的引物序列Table 1 Sequences of primers used in the present study

1.2.11 Western Blot 檢測腫瘤組織中凋亡因子蛋白水平的表達(dá) 稱取腫瘤組織50 mg，加入RIPA 組織裂解液，在電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)中研磨，提取總蛋白，整個(gè)提取過程置于冰上進(jìn)行。用BCA 試劑盒檢測各組樣品蛋白濃度。各取30 μg 總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)印法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，加入一抗，4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌3 次，每次10 min，加入二抗繼續(xù)室溫孵育1 h，ECL 顯色并拍照。Image J分析條帶灰度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達(dá)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析；采用Origin 2018 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCU 聯(lián)合CDDP 對(duì)4T1 腫瘤細(xì)胞增殖的影響

首先在體外采用CCK-8 實(shí)驗(yàn)考察單獨(dú)使用SCU、CDDP 以及SCU 聯(lián)合CDDP 給藥對(duì)4T1 細(xì)胞的增殖抑制作用。當(dāng)使用濃度為10、20、40、80 μmol/L 的CDDP 處理細(xì)胞48 h 后，與空白對(duì)照組相比，各組4T1 細(xì)胞的相對(duì)增殖率分別為91.14%、80.23%、65.33%和41.83%。其中，當(dāng)CDDP 濃度為40 μmol/L 時(shí)，4T1 的增殖率明顯減少，差異具有顯著意義（P＜0.05）；增大濃度到80 μmol/L 時(shí)，4T1的增殖率進(jìn)一步降低，與空白對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01）（圖1A）。當(dāng)使用濃度為25、50、100、200 μmol/L 的SCU 處理細(xì)胞后，與空白對(duì)照組相比，各組4T1 細(xì)胞的相對(duì)增殖率分別為92.67%、88.12%、78.16%和62.50%。其中，當(dāng)SCU 濃度為100 μmol/L 時(shí)，4T1 的增殖率明顯減少，差異具有顯著性（P＜0.05）；增大濃度到200 μmol/L 時(shí)，4T1 的增殖率進(jìn)一步降低，與空白對(duì)照組相比，差異具有極顯著意義（P＜0.01）（圖1B）。基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇200 μmol/L SCU 與80 μmol/L CDDP 聯(lián)合（SCU+CDDP）作用于4T1 細(xì)胞并觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：200 μmol/L SCU、80 μmol/L CDDP 以及SCU+CDDP 對(duì)細(xì)胞的相對(duì)增殖率分別為60.12%、58.23%和26.63%，與空白對(duì)照組相比，各組均具有極顯著性差異（P＜0.01）。其中，與200 μmol/L SCU 及80 μmol/L CDDP 相比，SCU+CDDP 對(duì)4T1 的抑制作用更為明顯，差異具極顯著意義（P＜0.01）（圖1C）。上述結(jié)果表明加入SCU 聯(lián)合用藥后能夠增強(qiáng)CDDP 對(duì)4T1 細(xì)胞的增殖抑制作用。

圖1 CDDP、SCU 及SCU 聯(lián)合CDDP 對(duì)4T1 細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of CDDP,SCU and CDDP+SCU on the proliferation of 4T1 cells

基于抗增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇200 μmol/L SCU、80 μmol/L CDDP 以及SCU+CDDP 進(jìn)行后續(xù)的遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)。

2.2 SCU 聯(lián)合CDDP 對(duì)4T1 腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組藥物對(duì)4T1 細(xì)胞遷移能力影響，結(jié)果如圖2 所示，相比于空白對(duì)照組，200 μmol/L SCU 組與80 μmol/L CDDP 組4T1 細(xì)胞遷移能力均下降，且結(jié)果具有極顯著性差異（P＜0.01），SCU 單藥組細(xì)胞劃痕面積愈合率為51.21%±4.32%，CDDP 單藥組細(xì)胞劃痕面積愈合率為40.33%±4.38%，并伴隨少量細(xì)胞的脫落壞死，細(xì)胞向中線遷移減慢；而SCU+CDDP 聯(lián)合用藥組細(xì)胞遷移能力明顯減弱，細(xì)胞劃痕面積愈合率為21.78%±4.18%，幾乎未見細(xì)胞向中線遷移，表明SCU 聯(lián)合CDDP 能更有效抑制乳腺癌4T1 細(xì)胞的遷移能力，與空白對(duì)照組以及SCU 和CDDP 單用組相比，差異具有極顯著意義（P＜0.01）。

圖2 CDDP、SCU 及SCU 聯(lián)合CDDP 對(duì)4T1 腫瘤細(xì)胞遷移的影響Fig.2 Effect of CDDP,SCU and SCU+CDDP on the migration capacity of 4T1 cells

本研究又進(jìn)行了Transwell 實(shí)驗(yàn)，檢測各組藥物作用于4T1 細(xì)胞48 h 后對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響。如圖3 所示，與空白對(duì)照組相比，200 μmol/L SCU 組與80 μmol/L CDDP 組穿過小室膜細(xì)胞數(shù)均極顯著減少（P＜0.01），表明4T1 細(xì)胞侵襲能力減弱；SCU 與CDDP 聯(lián)合用藥組穿過小室膜細(xì)胞數(shù)減少更為顯著，作用更明顯，表明聯(lián)合用藥對(duì)4T1 細(xì)胞的侵襲能力抑制作用最強(qiáng)，加入SCU 后能夠增強(qiáng)CDDP 對(duì)乳腺癌4T1 細(xì)胞的抑制作用，差異具有極顯著意義（P＜0.01）。

圖3 CDDP、SCU 及SCU 聯(lián)合CDDP 對(duì)4T1 腫瘤細(xì)胞侵襲的影響Fig.3 Effect of CDDP,SCU and SCU+CDDP on the invasion capacity of 4T1 cells

2.3 SCU 聯(lián)合CDDP 對(duì)4T1 腫瘤細(xì)胞凋亡的影響

為了進(jìn)一步考察SCU 對(duì)CCDP 抗腫瘤增敏作用，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測兩藥單用和聯(lián)合對(duì)4T1 腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。檢測結(jié)果如圖4 所示，與空白對(duì)照組相比，SCU 組、CDDP 組凋亡率增加，分別為32.26%、47.87%，差異具有極顯著性意義（P＜0.01）；而SCU+CDDP 聯(lián)合用藥組凋亡率更高，凋亡率為71.53%，與單用SCU 或CDDP 組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01），提示SCU 能增強(qiáng)CDDP 對(duì)乳腺癌4T1 細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。

圖4 CDDP、SCU 及SCU 聯(lián)合CDDP 對(duì)4T1 腫瘤細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of CDDP,SCU and SCU+CDDP on apoptosis of 4T1 cells

2.4 SCU 聯(lián)合CDDP 對(duì)4T1 荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證SCU 對(duì)CDDP 抗4T1 腫瘤細(xì)胞的增敏作用，接下來，在體內(nèi)水平考察了SCU 聯(lián)合CDDP 對(duì)4T1 荷瘤小鼠腫瘤生長的作用。結(jié)果如圖5 所示，在接種腫瘤17 d 后，與空白對(duì)照組相比，60 mg/kg SCU 組、3.0 mg/kg CDDP 組腫瘤平均體積分別減少了31.9%和36.6%，差異具有極顯著意義（P＜0.01）。而SCU+CDDP 聯(lián)合用藥組腫瘤平均體積減少的更多，減少了49.7%，與SCU 組及CDDP 組比較差異具有顯著意義（P＜0.05），提示兩藥聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著抑制4T1 細(xì)胞體內(nèi)的生長作用。同時(shí)，整個(gè)給藥期間，各給藥組均未引起小鼠體重明顯的下降（圖5A）。提示SCU 聯(lián)合CDDP 在抑制4T1 荷瘤小鼠腫瘤生長的同時(shí)并未引起明顯的毒性。

圖5 SCU 聯(lián)合CDDP 對(duì)B16 荷瘤小鼠腫瘤體積和體重的影響Fig.5 Effect of SCU+CDDP on tumor volume and weight of 4T1-bearing mice

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠并剝離腫瘤組織稱重，如圖6 所示，空白對(duì)照組、60 mg/kg SCU 組、3.0 mg/kg CDDP 組以及SCU+CDDP 給藥組的瘤重分別為1.17±0.21、0.42±0.13、0.34±0.24 和0.16±0.15 g。與空白對(duì)照組相比，60 mg/kg SCU 組、3.0 mg/kg CDDP組瘤重分別減少64.2%與70.5%，具有極顯著性差異（P＜0.01）；SCU+CDDP 組瘤重減少86.2%，具有極顯著性差異（P＜0.01）。由以上結(jié)果可知，SCU 能夠增強(qiáng)CDDP 對(duì)4T1 在體腫瘤的抑制作用。

圖6 SCU 聯(lián)合CDDP 對(duì)4T1 荷瘤小鼠腫瘤生長的影響Fig.6 Effect of the combination of SCU and CDDP on the growth of 4T1 tumor from mice

2.5 SCU 聯(lián)合CDDP 對(duì)4T1 荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞形態(tài)、腫瘤組織壞死的影響

接下來，通過H&E 染色觀察SCU 聯(lián)合CDDP對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)和腫瘤組織壞死的影響。首先觀察腫瘤異型性，結(jié)果如圖7 所示：各組腫瘤細(xì)胞排列紊亂，層次多，失去方向性；腫瘤細(xì)胞大小不一，形態(tài)各異，細(xì)胞核大小、形態(tài)及染色不一，核質(zhì)比例失調(diào)，病理性核分裂多見，呈不對(duì)稱性、多極性分裂，腫瘤異型性高。

圖7 SCU 聯(lián)合CDDP 對(duì)4T1 荷瘤小鼠腫瘤血管密度的影響Fig.7 Effect of the combination of SCU and CDDP on the micro-vessel density in 4T1 tumor tissue

觀察腫瘤組織壞死及腫瘤間質(zhì)情況，對(duì)照組腫瘤組織核深染色，腫瘤細(xì)胞密度減少，可見核固縮、破碎，胞漿外溢，可見片狀壞死區(qū)域及大量微血管；60 mg/kg SCU 組及3.0 mg/kg CDDP 組腫瘤組織核深染，少見凋亡形態(tài)學(xué)改變，少見核固縮及部分微血管；而SCU 聯(lián)合CDDP 組腫瘤組織核深染，少見凋亡形態(tài)學(xué)改變，少見核固縮并且?guī)缀鯚o血管。對(duì)各組血管密度進(jìn)行分析，可知SCU 聯(lián)合CDDP 能夠抑制腫瘤微血管的形成，從而抑制在體腫瘤4T1 的生長（P＜0.01）。

2.6 SCU 聯(lián)合CDDP 對(duì)4T1 荷瘤小鼠腫瘤組織中凋亡因子表達(dá)的影響

Bcl家族是重要的凋亡相關(guān)基因，在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，其中Bcl-2是阻止細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因，而Bax是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因[28-29]。Caspase 家族是一組半胱氨酸蛋白酶，在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中起到重要作用，其中以Caspase-3 與Caspase-9 最為關(guān)鍵，其激活是細(xì)胞凋亡的特異性標(biāo)志[30-31]。為進(jìn)一步探討SCU 聯(lián)合CDDP 抑制4T1 在體腫瘤發(fā)生及生長的可能機(jī)制，本文采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測腫瘤組織中凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，進(jìn)一步探討SCU 聯(lián)合CDDP 對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測各給藥組對(duì)4T1 腫瘤組織中細(xì)胞線粒體凋亡通路因子的表達(dá)變化。結(jié)果如圖8 所示，與空白對(duì)照組相比，60 mg/kg SCU 組、3.0 mg/kg CDDP 組及SCU+CDDP 組腫瘤組織中的Caspase-3與Caspase-9表達(dá)均上調(diào)，其中Caspase-3分別增加35.5%、57%及121%，具有極顯著性差異（P＜0.01），而Caspase-9分別增加42.3%、75.8%及129.5%，具有極顯著性差異（P＜0.01）。與SCU 或CDDP 單用組相比，聯(lián)合組（SCU+CDDP）Caspase-3和Caspase-9mRNA 表達(dá)水平明顯增加，差異具極顯著性（P＜0.01）。

圖8 SCU 聯(lián)合CDDP 對(duì)4T1 荷瘤小鼠腫瘤組織中凋亡因子mRNA 水平的影響Fig.8 Effect of the combination of SCU and CDDP on the mRNA levels of apoptotic factors in 4T1 tumor tissue

與此同時(shí)，60 mg/kg SCU 組、3.0 mg/kg CDDP組及SCU+CDDP 組腫瘤組織中的Bax表達(dá)也較空白對(duì)照組明顯上調(diào)，分別增加23.2%、27.3%及88.5%，差異具有極顯著性意義（P＜0.01）。且與SCU 或CDDP單藥組相比，SCU+CDDP 聯(lián)合組的Bax水平上調(diào)更明顯，差異具有極顯著性（P＜0.01）；抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA 表達(dá)則正好相反。與空白對(duì)照組相比，60 mg/kg SCU 組、3.0 mg/kg CDDP 組及SCU+CDDP組腫瘤組織中的Bcl-2表達(dá)均下調(diào)，分別減少27.3%、33.3%及52.7%，具有極顯著性差異（P＜0.01）。且SCU+CDDP 聯(lián)合組的Bcl-2水平較SCU 和CDDP單藥組極顯著下調(diào)（P＜0.01）。

通過Western Blot 在蛋白水平上考察各給藥組對(duì)4T1 腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果如圖9 所示，與空白對(duì)照組相比，60 mg/kg SCU 組、3.0 mg/kg CDDP 組及SCU+CDDP 組腫瘤組織中的Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Cspase-9 以及Cleaved-Caspase-9 蛋白表達(dá)均極顯著上調(diào)（P＜0.01）。其中，SCU+CDDP 聯(lián)用組Caspase-3 的表達(dá)較SCU 單用組顯著上調(diào)（P＜0.05）；Cleaved-Caspase-3、Cspase-9 以及Cleaved-Caspase-9 蛋白表達(dá)均極顯著上調(diào)（P＜0.01）。與此同時(shí)，60 mg/kg SCU 組、3.0 mg/kg CDDP 組及SCU+CDDP 組腫瘤組織中的凋亡蛋白Bax 的表達(dá)也較空白對(duì)照組極顯著上調(diào)（P＜0.01），且聯(lián)用組較CDDP 單用組Bax 的上調(diào)更明顯，差異具有極顯著性（P＜0.01）。60 mg/kg SCU、3.0 mg/kg CDDP 及SCU+CDDP 處理均導(dǎo)致抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），且聯(lián)用組較SCU 或CDDP單用組下調(diào)更明顯，差異具顯著意義（P＜0.05）。

圖9 SCU 聯(lián)合CDDP 對(duì)4T1 荷瘤小鼠腫瘤組織中凋亡因子蛋白表達(dá)的影響Fig.9 Effect of the combination of SCU and CDDP on the expression of apoptotic proteins in 4T1 tumor tissue

以上結(jié)果證實(shí)了SCU 聯(lián)合CDDP 可通過降低腫瘤細(xì)胞線粒體通路凋亡因子Bcl-2/Bax 比例進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，由此有可能進(jìn)一步影響到腫瘤的發(fā)生和生長的過程。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)SCU 聯(lián)合CDDP 的抗乳腺癌作用進(jìn)行了體內(nèi)外探究，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SCU 聯(lián)合CDDP 對(duì)乳腺癌的抑制作用明顯優(yōu)于單藥。CCK-8實(shí)驗(yàn)證實(shí)與單獨(dú)使用200 μmol/L 的SCU 及80 μmol/L的CDDP 相比，兩者聯(lián)合可顯著抑制4T1 細(xì)胞的增殖（P＜0.01）；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)SCU 與CDDP 聯(lián)合用藥組較空白對(duì)照組和單藥組能極顯著抑制4T1 細(xì)胞的遷移和侵襲能力（P＜0.01）；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與對(duì)照組和單藥組相比，聯(lián)合用藥組的4T1 細(xì)胞凋亡率最高。

體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SCU 聯(lián)合CDDP 用藥可明顯抑制4T1 腫瘤生長，與空白對(duì)照組相比，60 mg/kg SCU 組與3.0 mg/kg CDDP 組瘤重分別減少64.2%與70.5%，SCU 聯(lián)合CDDP 組瘤重減少86.2%。同時(shí)SCU 聯(lián)合CDDP 組還可顯著降低腫瘤組織的微血管密度（P＜0.01），證實(shí)SCU 在體內(nèi)水平也具有抗乳腺癌的作用。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法以及Western Blot 法檢測腫瘤組織中凋亡相關(guān)因子的基因及蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，SCU 及CDDP 單藥組作用后，抗凋亡蛋白Bcl-2 水平均下調(diào)，而促凋亡蛋白Bax 水平明顯上調(diào)，Caspase-3 及Caspase-9 表達(dá)水平均增高，這一結(jié)果在SCU 聯(lián)合CDDP 用藥組更為顯著，提示SCU 能夠促進(jìn)CDDP 乳腺癌4T1 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。

綜上所述，本研究表明SCU 體內(nèi)外均具有抑制4T1 腫瘤的生長的作用，這一作用不僅與其體外直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力及促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)，也與其抑制腫瘤微血管密度、激活凋亡因子通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。本次研究僅僅是從體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的角度初步研究了SCU 對(duì)4T1 腫瘤生長的抑制作用，后續(xù)還需要對(duì)具體的作用機(jī)制進(jìn)行更為深入的研究和驗(yàn)證，以便全面、準(zhǔn)確地掌握SCU 的藥理作用規(guī)律，提高腫瘤治療效果并減少不良反應(yīng)。