基于HS-SPME-GC-MS 與電子鼻分析芹菜貯藏期間揮發性物質的變化

蘆佳琪，吳玉珍，張 瑞，韓晶晶，熊愛生，郁志芳,

（1.南京農業大學食品科技學院，江蘇南京 210095；2.南京農業大學園藝學院，江蘇南京 210095）

芹菜（Apium graveolensL.）是傘形科重要蔬菜作物之一，近年來我國芹菜種植面積保持在1000 萬畝以上，總產量大于2500 萬噸[1]。研究表明，芹菜中膳食纖維可有效改善人們的腸胃功能，維生素C、維生素B2 的含量遠高于大白菜等蔬菜[2]，其中的芹菜素、槲皮素和木犀草素等黃酮類物質具有抗炎、抗氧化和心血管保護功能[3]。

芹菜因其獨特的風味而受到消費者的喜愛，但芹菜組織脆嫩、含水量高，采后易受機械傷害，失水萎蔫，隨貯藏時間延長會發生腐敗變質，產生異味，因此貯藏期間芹菜香氣的變化是評價其品質的重要指標，確定貯藏期間芹菜特征香氣成分，可為貯藏期間芹菜新鮮度的判斷提供理論基礎。迄今為止，關于芹菜籽、芹菜精油和加工后芹菜的揮發性物質研究較多，但對于新鮮芹菜葉片中的特征揮發性物質的組成及貯藏期間采后芹菜葉片揮發性物質的變化規律鮮有研究報道。鮑辰卿等[4]采用氣相色譜-質譜/嗅聞聯用儀分析4 種芹菜籽油樹脂，鑒定出洋川芎內酯、β-瑟林烯等物質是芹菜籽油樹脂中的關鍵香氣成分。Sellami 等[5]采用頂空固相微萃取技術結合氣相色譜-質譜聯用分析提取的芹菜精油，鑒定出主要揮發性物質為Z-3-丁基苯酞（27.8%～38.4%）和3-丁基-4,5-二氫苯酞（34.2%～41.0%）。程碧君等[6]采用HSSPME-GC-MS 檢測干燥后的芹菜葉粉，發現芹菜葉粉揮發性成分主要由檸檬烯（88.03%）和月桂烯（4.09%）組成。目前果蔬的香氣成分分析技術主要有電子鼻和頂空固相微萃取技術結合氣相色譜-質譜聯用（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）等[7-8]。電子鼻（E-nose）能快捷無損區分樣品[9]，表征揮發性物質整體特征，但無法準確定性定量分析，而頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術可以進行揮發性物質定性定量檢測[10]。HS-SPME-GC-MS 結合電子鼻可以更全面、準確地分析貯藏期間芹菜葉片中揮發性物質組成和含量變化。

本研究采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術和電子鼻對新鮮和貯藏期間芹菜葉片香氣進行分析，結合揮發性物質香氣活性值（odour active values，OAV）篩選芹菜的特征揮發性物質，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析（cluster analysis，CA）探究貯藏期間芹菜葉片揮發性物質的變化規律，為進一步明確采后芹菜的香氣特征提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芹菜 采于江蘇宿遷生產基地，品種為‘瑞斯特’，采收時間2022 年11 月4 日；3-辛醇（98%）購于麥克林公司；正構烷烴（C7～C40標準品）購于安譜實驗公司。

PEN3 型電子鼻 德國AIRSENSE 公司；Tri-Plus 300 型頂空自動進樣器、TSQ 9000 三重四極桿GC-MS/MS 美國Thermo Scientific 公司；萃取頭（60 μm DVB/CAR/PDMS）美國Supelco 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 芹菜樣品的處理 采收的芹菜以冷藏運輸方式在4 h 內運送至實驗室。挑選大小基本一致、無機械傷、無黃葉和病蟲害的芹菜，置于常溫（20.0±1.0 ℃）、相對濕度90%±5%條件下貯藏，于0、3、7、9 d 取樣。每次實驗樣品3000 g。將采集的芹菜葉片，液氮冷凍后磨成粉末存放于-20 ℃冰箱；所有樣品采集后，集中進行揮發性物質的測定。實驗設三個生物學重復樣品。

1.2.2 芹菜揮發性物質的萃取 HS-SPME 萃取芹菜中揮發性物質，參考田震等[11]方法并做了改動。通過HS-SPME 萃取芹菜葉片中的揮發性物質，將1 g 芹菜葉片粉末，20 μL 內標物3-辛醇（0.8 mg/mL）加到20 mL 頂空瓶中，于50 ℃孵化5 min。65 μm PDMS/DVB 固相微萃取頭伸入頂空瓶40 mm，頂空萃取45 min，提取揮發性物質后，自動進樣至氣相色譜-質譜（GC-MS）系統，250 ℃解吸5 min。

1.2.3 GC-MS 條件 條件參考Wu 等[12]、Cai 等[13]方法并略做修改。GC 條件：采用HP-5 石英毛細柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為He，流速1 mL/min，不分流；升溫程序：從初始溫度40 ℃開始，以5 ℃/min 的加熱速率升溫至136 ℃，維持3 min，然后1 ℃/min 升溫至140 ℃，維持6 min，最后10 ℃/min升高到240 ℃，維持1 min。

MS 條件：在電子電離（EI）條件下，質譜的離子源溫度為300 ℃，電子能70 eV，掃描范圍33～500 amu。

1.2.4 芹菜揮發性物質的定性定量分析 通過NIST 與Wiley 標準譜庫對GC-MS 檢測結果進行分析，選擇匹配度大于80%的物質；將正構烷烴標準品按1.2.3 條件進樣，得到正構烷烴的保留時間，對各化合物的保留指數（RI）進行計算，并結合數據庫中化合物保留指數對比鑒定。

式中：tx表示待測物質的保留時間，min，tn表示待測物質流出前正構烷烴的保留時間，min，tn+1表示待測物質流出后正構烷烴的保留時間，min，且tn＜tx＜tn+1，n 表示碳原子數。

根據內標法（3-辛醇作為內標）對揮發性物質做定量分析，公式如下：

式中：Ci表示任一組分的含量，μg/kg，Cis表示3-辛醇的質量濃度，μg/kg；Ai表示任一組分的峰面積，Ais表示3-辛醇的峰面積。

1.2.5 芹菜香氣活力值OAV 的計算 通過計算香氣活力值評估揮發性物質的貢獻，OAV 值≥1 的化合物通常被認為對香氣特征有很大貢獻。OAV 值計算公式如下：

式中：Ci表示任一組分的含量，μg/kg；Ti表示該物質在水中的閾值，μg/kg。

1.2.6 電子鼻測定 參考Wu 等[12]方法并進行修改。稱1 g 芹菜葉片粉末于20 mL 頂空瓶中，用PTFE硅膠墊蓋密封并室溫（20.0±1.0 ℃）平衡30 min。樣品采集時間：180 s；傳感器清洗時間：60 s；進樣流量：150 mL/min。設置5 個生物學重復。PEN3 E-nose各個傳感器及對應的性能描述如表1 所示[14]。

表1 電子鼻傳感器性能描述Table 1 Function description of E-nose sensors

1.3 數據處理

電子鼻數據為5 次生物學重復測定的平均值，GC-MS 數據為3 次生物學重復測定的平均值。利用Origin 2022b 繪制雷達圖、主成分分析（PCA）和Pearson 相關性分析，使用SPSS 17.0 統計軟件進行數據分析，以P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 貯藏期間芹菜葉片揮發性物質的HS-SPME-GCMS 分析

利用HS-SPME 與GC-MS 聯用的方法，分析貯藏期間芹菜揮發性物質成分及含量。共鑒定出108種化合物（表2），新鮮和貯藏期間芹菜揮發性物質均穩定在105 種以上，遠多于文獻報道的74 種[15]；108 種物質中醇類21 種、倍半萜類21 種、酯類12 種、單萜類11 種、烯烴類7 種、苯酞類6 種、酮類6 種、酸類4 種、含氧萜類化合物4 種、醛類2 種和14 種其他類物質，其中醇類和倍半萜類物質種類數量遠大于現有文獻報道[15-16]。貯藏期間芹菜中新增的揮發性物質有α-愈創烯、3-(2,6,6-三甲基-1-環己烯基)-2-丙烯-1-醇和5,7-十二烷二炔-1,12-二醇，其中后兩種物質為醇類。由圖1 可知，新鮮芹菜總揮發性物質含量為165682.48 μg/kg，其中單萜類和苯酞類物質是主要的揮發性物質，占比分別為52.92%、19.93%，與Turner 等[17]、Xia 等[18]研究結果相似。貯藏9 d 期間總揮發性物質含量下降了40.92%，主要是單萜類物質和烯烴類物質含量減少，其中減少最多的單萜類物質下降了51.76%。

圖1 不同貯藏時間芹菜葉片各類型揮發性物質占比（a）和含量（b）Fig.1 Percent (a) and content (b) of volatile compounds of celery leaves during storage

表2 不同貯藏時間芹菜葉片的揮發性物質組成和含量Table 2 Composition and content of volatile compounds in celery leaves during storage

單萜類物質是芹菜揮發性物質中含量最高的物質，貯藏期間含量和占比呈下降趨勢，含量從87675.05 μg/kg 降低至42293.06 μg/kg，占比從52.92%下降至43.20%。其中具有清新的柑橘、薄荷氣味的D-檸檬烯和提供青草香和橙花油香氣的別羅勒烯是單萜類物質中占比較大的揮發性物質[19]。貯藏期間芹菜葉片中D-檸檬烯和別羅勒烯分別占揮發性物質總量的55.39%～21.24%、10.05%～11.32%，D-檸檬烯含量下降了81.5%，別羅勒烯第9 d 含量較第0 d 下降了33.41%。

倍半萜類物質在新鮮芹菜中含量為13139.78 μg/kg，貯藏期間占比從第0 d 的7.93%下降到第3 d的5.99%，第9 d 增大至8.75%。倍半萜類物質中丁香、松油香的β-瑟林烯和木香的石竹烯被認為是芹菜香氣重要的貢獻者[20]。貯藏期間β-瑟林烯和石竹烯含量在第3 d 分別下降了51.77%、26.6%，第7 d含量上升，分別是第3 d 的1.5 倍、1.6 倍。

苯酞類物質是芹菜中主要的揮發性物質，貯藏期間占比逐漸上升，從19.93%增加至28.97%，含量從33024.49 μg/kg 降低至28359.89 μg/kg。具有藥草香和芹菜特殊氣味的苯酞類物質洋川芎內酯A 和瑟丹酸內酯被文獻報道為芹菜特征香氣物質[21]。新鮮芹菜中洋川芎內酯A 和瑟丹酸內酯含量分別為14479.04、12379.44 μg/kg。貯藏期間洋川芎內酯A 呈下降趨勢，下降了60.62%，瑟丹酸內酯含量上升了42.95%。

貯藏期間芹菜中的烯烴類物質種類較少，含量占比為7.56%～4.68%；醇類、酯類、醛類、酸類和酮類物質含量較少，共占比為3.60%～5.47%。

本研究還檢測到目前少有報道的（R）-異香芹萜、α-芹子烯、α-律草烯、新植二烯和1-甲基萘等物質。（R）-異香芹萜具有類似檸檬的香氣[22]，在新鮮芹菜中含量豐富，為11860.51 μg/kg。淡丁香氣味的α-芹子烯和甜橙香氣的α-律草烯[12]，貯藏期間含量分別下降了56.17%、11.79%。新植二烯具有清香氣且刺激性較強[23]，新鮮芹菜中新植二烯含量為7689.84 μg/kg，貯藏期間含量降低了54.16%。1-甲基萘有類似萘的特殊氣味[24]，貯藏期間含量下降了35.36%。

2.2 貯藏期間芹菜特征揮發性物質的OAV 分析

HS-SPME-GC-MS 分析獲得的各物質含量并不能確定貯藏期間芹菜的關鍵和特征性揮發性物質，故而采用揮發性物質香氣活性值（OAV）對貯藏期間芹菜關鍵揮發性物質進行篩選。當OAV 值≥1 時，該化合物對芹菜整體香氣有一定影響，當OAV 值＞10 時認為該化合物對芹菜整體香氣貢獻極大。如表3 所示，貯藏期間芹菜共有31 種揮發性物質OAV 值大于1，主要是萜類和苯酞類物質，0～7 d 特征揮發性物質有31 種且組成相同，第9 d 特征揮發性物質減少了2 種，減少的是萜品油烯和對傘花烴。

表3 不同貯藏時間芹菜葉片OAV＞1 的特征揮發性物質Table 3 Characteristic volatile compounds with OAV higher than 1 in celery leaves during storage

新鮮（0 d）芹菜葉片中，D-檸檬烯、別羅勒烯、1-甲基萘和洋川芎內酯A 的OAV 值大于100，提示這些物質可能是新鮮芹菜的關鍵香氣成分。貯藏期間，D-檸檬烯的OAV 值呈下降趨勢，別羅勒烯OAV 值第0、3、7 d 基本不變，第9 d 開始下降，表明貯藏期間芹菜葉片中薄荷香強度逐漸降低，草香和橙花油香氣減弱。新鮮芹菜中10-烴基香葉醇OAV 值＜1，貯藏9 d 后萜品油烯、對傘花烴的OAV 值＜1，表明具有玫瑰花香的10-烴基香葉醇是貯藏1～9 d 芹菜的特征揮發性物質，提供松木香的萜品油烯和提供檸檬香的對傘花烴是新鮮和貯藏1～7 d 的芹菜的特征揮發性物質。具有藥草香和芹菜氣味的苯酞類物質瑟丹酸內酯在第7 d 的OAV 值較大，表明第7 d 芹菜葉片中藥草香和芹菜氣味濃郁。此外，貯藏期間具有類似萘特殊氣味的1-甲基萘OAV 值（356.63～551.72）較大。

根據31 種關鍵揮發性物質的OAV 值繪制熱圖，并通過層次聚類對其進行分析（圖2），結果表明芹菜香氣0 d 以桃金娘烯醇、（-）-乙酸香芹酯、α-蒎烯、D-檸檬烯、β-瑟林烯等為主要特征揮發性物質，具有薄荷香和青草香；（-）-異丁香烯是第3 d 的主要差異物質，提供了丁香香氣；第7 d 主要以10-羥基香葉醇、β-蒎烯、對薄荷-1,3,8-三烯、石竹烯、瑟丹酸內酯為主要特征揮發性物質，具有甜香、木香和樟腦香；第9 d 以3-六氫-丁基苯酞、（E）-藁本內酯為關鍵香氣物質，具有辛辣和藥草氣味。通過芹菜特征揮發性物質的變化判斷芹菜的新鮮程度，為確定芹菜的最佳貨架期提供了理論基礎。

圖2 不同貯藏時間芹菜葉片的特征揮發性物質聚類熱圖Fig.2 Cluster heat map of characteristic volatile compounds of celery leaves during storage

2.3 電子鼻分析貯藏期間芹菜葉片揮發性物質

對新鮮和貯藏不同時間后的芹菜葉粉進行電子鼻檢測。貯藏期間，芹菜氣味在10 個傳感器上的響應值不同（圖3）。新鮮（0 d）芹菜在各傳感器上響應值最大，說明芹菜剛采收后氣味更濃郁。不同貯藏時期芹菜氣味的變化主要體現在W5S、W1S、W1W、W2S、W2W 傳感器上，這些傳感器對氮氧化物、萜烯類、醇類和部分芳香族化合物響應敏感，表明貯藏期間芹菜中氮氧化物、萜烯類、醇類和部分芳香族揮發性物質存在差異。

圖3 不同貯藏時間芹菜葉片電子鼻的雷達圖Fig.3 E-nose radar diagram of celery leaves during storage

采用主成分分析對電子鼻響應值數據進行分析，結果見圖4。PC1 的貢獻率為90.9%，PC2 貢獻率為6.8%，總貢獻率97.9%，說明PCA 可以很好地反映樣本信息。第0、3、7、9 d 分布在不同象限，提示貯藏期間芹菜揮發性成分存在差異。第3、9 d 在PC2 軸位置接近，表明兩者的主要揮發性物質相似；第3、7、9 d 在PC1 軸上與0 d 區分明顯，故新鮮芹菜揮發性物質與第3、7、9 d 的芹菜存在顯著差異。另外，W1S、W2S 對于第四象限貢獻值較大，可以更好地識別第0 d 的樣品。

圖4 不同貯藏時間芹菜葉片電子鼻的PCA（a）、Loadings 分析圖（b）Fig.4 E-nose PCA (a)，Loadings analysis chart (b) of celery leaves during storage

2.4 HS-SPME-GC-MS 與電子鼻相關性分析

以HS-SPME-GC-MS 鑒定含量較高的21 種化合物與10 個電子鼻感應器響應值進行Pearson 相關性分析，結果見圖5。W1C、W3C、W5C 與乙酸芳樟酯、Z-亞丁基苯酞、3-六氫-丁基苯酞成正相關，表明W1C、W3C、W5C 傳感器對芳香族化合物敏感；W1W、W6S 與D-檸檬烯、反式氧化檸檬烯、二氧化萜二烯成正相關，表明兩個傳感器對萜烯類化合物響應較大，W1S、W2S 感應器響應值與異香芹醇、γ-松油烯、5-戊基-1,3-環己二烯含量成正相關，但W1S、W2S 乙酸芳樟酯成負相關。W1C、W3C、W5C、W1W、W2S 傳感器識別出的揮發性物質與其性能描述基本一致，表明引起電子鼻傳感器響應值變化的物質主要是萜類、醇類、芳香型揮發性物質（r≥0.80，P＜0.05）。結合貯藏期間具有關聯性物質的變化，電子鼻技術可應用于芹菜品質變化的快速判別。

圖5 HS-SPME-GC-MS 與電子鼻相關性分析熱圖Fig.5 Heat map of correlation analysis between HS-SPME-GC-MS and E-nose

3 討論與結論

Turner 等[15]比較了2018 年和2020 年收獲芹菜的揮發性物質，分別鑒定出65 種、74 種化合物，其中單萜類物質占比最大，分別為55%、88%。Reale 等[16]測定四種不同芹菜的揮發性物質，檢測到白芹、黑芹、野生型芹菜和普通芹菜揮發性物質分別有18、16、13、18 種，四種芹菜中檸檬烯含量最高，相對含量達到50%。本研究以冬季采收的芹菜葉片為材料，利用HS-SPME-GC-MS 鑒定出更多的揮發性物質數量，共檢測出108 種化合物，鑒定出的揮發性物質種類遠多于文獻的報道，其中主要是單萜類和醇類物質數量多于現有報道[15-16]。此外，芹菜特征揮發性物質1-甲基萘是本研究檢測到的特有物質，鮮有文獻報道。造成這些差異的原因可能與芹菜基因型、收獲季節、品種、取樣部位、提取和分析方法的不同等有關。

貯藏期間，芹菜葉片中揮發性物質的含量總體呈逐漸下降趨勢，且萜類物質占比逐漸減小，苯酞類和醇類物質占比逐漸增加。研究報道萜類物質在空氣易被氧化生成含氧化物、萜烯醇類等，其中檸檬烯氧化后生成香芹醇，紫蘇醇等氧化衍生物[28]。推測貯藏期間芹菜葉片中萜類物質占比減少，醇類物質占比增加，與檸檬烯等萜類物質被氧化為香芹醇和紫蘇醇等醇類物質有關。另外，Song 等[29]研究結果表明萜類物質合成與萜類合酶有關，因此貯藏期間芹菜葉片中萜類物質含量減少可能與萜類合酶活性降低有關。目前關于植物中苯酞的生物合成的途徑尚未明確，Yan 等[30]研究表明茉莉酸、脫落酸等植物激素在調節苯酞類物質的合成中起著重要作用，推測芹菜葉片中苯酞類物質含量的變化可能與植物激素調節有關。Wu 等[12]利用GC-MS 比較4 ℃和20 ℃貯藏條件下菊花腦揮發性物質差異，發現低溫延緩了菊花腦揮發性物質的損失。李雪等[31]研究不同貯藏溫度油麥菜采后香氣成分變化，結果表明4 ℃貯藏可以減緩油麥菜香氣成分的釋放。基于以上研究，推測貯藏溫度可能影響采后芹菜中的揮發性物質，在后續的研究中將探討不同溫度下貯藏對芹菜揮發性物質的影響。

GC-MS 與電子鼻結合已廣泛應用于果蔬的香氣成分鑒定，GC-MS 可以分析貯藏期間芹菜葉片中揮發性化合物的種類和含量變化，但無法分析樣品香氣成分整體特征變化[32]。而電子鼻可以識別樣品整體香氣輪廓，具有簡便、無損、高效的特點[9]。電子鼻結合貯藏期間芹菜葉片特征揮發性物質的變化，可快速判別芹菜品質的變化。

本研究采用HS-SPME-GC-MS 和電子鼻技術分析20.0 ℃貯藏期間芹菜葉片揮發性物質的變化，共鑒定出108 種揮發性物質，單萜類和苯酞類物質為主要組分，新鮮芹菜總揮發性物質含量為165682.48 μg/kg，貯藏期間芹菜總揮發性物質含量逐漸降低，下降了40.92%，其中單萜類物質占比增大，苯酞類物質占比減小。結合OAV 值分析，得到D-檸檬烯和洋川芎內酯A 等31 種OAV＞1 的特征揮發性物質，芹菜香氣0～3 d 主要以D-檸檬烯等萜類物質的新鮮青草香為主，3 d 至第7 d 以10-羥基香葉醇、瑟丹酸內酯等醇類和苯酞類物質的甜香和木香為主，第9 d 則以（E）-藁本內酯等苯酞類物質刺激性的辛辣風味為主。PCA 結果表明電子鼻可以區分不同貯藏時間芹菜葉片的香氣，HS-SPME-GCMS 結合電子鼻技術可以更加全面、準確地分析貯藏期間芹菜葉片揮發性物質組成和含量及變化規律，本研究結果為明確芹菜的香氣特征和判別采后芹菜品質提供了理論基礎。