復配發酵劑對發酵香腸的品質及揮發性風味的影響

吳雙慧，楊梓垚，牛 茵，何濟坤，尹禮國，陳 娟,

（1.固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000；2.西南民族大學食品科學與技術學院，四川成都 610225）

發酵香腸是一種經過微生物發酵制成的具有特殊風味的發酵肉制品[1]，其品質與風味容易受到微生物影響。為了控制香腸的品質，在發酵過程中通常會加入微生物發酵劑，縮短香腸發酵的時間，保證香腸的感官品質和安全性[2]。乳酸菌和凝固酶陰性葡萄球菌是香腸中最常用的發酵劑[3]。在肉制品發酵過程中，乳酸菌可以發酵糖類產生乳酸，形成一些揮發性風味物質，改善肉制品的風味，同時可以降解肉中的蛋白質，提高肉制品的質地和口感，促進消化吸收[4-6]。葡萄球菌在發酵肉制品中的作用主要是產香、發色和保證安全性，是發酵肉中的功能性微生物[7]。Ge 等[8]發現從金華火腿中篩選的植物乳桿菌NJAU-01 可以明顯改善香腸的顏色和質地。Wang等[9]通過接種植物乳桿菌MSZ2 和木糖葡萄球菌YCC3 于發酵香腸中，發現接種木糖葡萄球菌或植物乳桿菌可以抑制發酵香腸的有害細菌，增加其游離脂肪酸含量，從而改善發酵香腸的風味。Xiao等[10]將植物乳桿菌R2 和木糖葡萄球菌A2 接種在中國干發酵香腸中，發現植物乳桿菌和木糖葡萄球菌促進了香腸中的蛋白水解和脂肪分解，改善了香腸的風味。

在香腸發酵劑的研究中，植物乳桿菌和木糖葡萄球菌復配的研究主要集中在對香腸加工品質及安全性能的影響[11-12]，發酵香腸的最適發酵溫度、菌種配比和接種量[13]，混菌發酵對香腸中脂肪酸氧化和組成[14]、理化和質構[15]的影響等方面。添加發酵劑通常能改善發酵香腸的風味特征，使發酵香腸的整體香氣更加豐富、濃郁。然而，目前關于以揮發性風味物質含量和香型為依據評價發酵劑性能的研究鮮見報道。

根據實驗室前期對大量發酵肉制品源葡萄球菌[16]和乳酸菌的分離和篩選結果，植物乳桿菌L77不僅生長速度快、產酸能力強、具有較好的生產適應性能（耐酸、耐鹽、耐亞硝酸鈉和耐低溫），同時具有較好的產蛋白酶活性；木糖葡萄球菌S120 具有優良的過氧化氫酶、硝酸鹽還原酶和脂肪酶活性。

本研究擬以植物乳桿菌L77 和木糖葡萄球菌S120 為試驗對象，利用HS-SPME/GC-MS 技術等方法對單菌和混菌發酵香腸的常規理化和微生物、揮發性風味物質、感官品質等進行分析，并采用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）法確定關鍵和修飾性風味化合物，按照發酵肉制品典型風味特征油脂香、奶油香、花果香和其他香型對關鍵和修飾性風味化合物進行分類，以風味物質的數量、含量及香型為主要依據，評價發酵劑的性能，以期開發一種產香型發酵劑，并為發酵劑性能的客觀評判提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料肉 購于四川省成都市武侯區洗面橋巷菜市場；試驗菌株 植物乳桿菌L77 分離于家庭制作的香腸，木糖葡萄球菌S120 分離于成都市農貿市場購買的煙熏臘腸，保存于西南民族大學食品科學與技術學院；亞硝酸鈉（食品級）購于四川金山制藥有限公司；抗壞血酸（食品級）購于盛達食品添加劑有限公司；硝酸鈉、葡萄糖、丙酮 分析純，購于成都科隆化學品有限公司；食鹽、白糖 購于超市；環己酮購于成都化夏化學試劑有限公司；PCA 培養基、MRS 肉湯/瓊脂培養基、TSB 培養基、MSA 培養基、結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA）購于青島海博生物科技有限公司。

MLS-3030CH 高溫高壓滅菌鍋 日本三洋電器股份有限公司；ZWY-240 恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；Trace DSQ 型氣相色譜-質譜（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）聯用儀（配置Triplus 自動進樣器）美國Thermo 公司；HR83 水分含量測定儀 METTLER-TOLEDO；UV1810S 紫外分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；CR-400 色差儀 柯尼卡美能達控股公司；XHF-D 高速分散器 寧波新芝生物有限公司；pH-4C+酸度計 成都世紀方舟科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株間的拮抗實驗 挑取乳酸菌和葡萄球菌的單菌落，以十字交叉的形式劃線于PCA 平板上，觀察交叉處是否有菌落生長。

1.2.2 實驗分組 本實驗分為三組，分別是不接種任何菌株的空白對照組、只接種植物乳桿菌L77 的發酵香腸（乳酸菌單菌組）、同時接種植物乳桿菌L77-木糖葡萄球菌S120 的發酵香腸（復配組），乳酸菌和葡萄球菌的接種量均為107CFU/g。分別購買兩批原料肉，進行兩批次發酵試驗，發酵至26 d 時，每批次各取樣150 g，混合均勻，用于常規理化和微生物指標以及揮發性風味物質的測定。

1.2.3 發酵香腸的制作

1.2.3.1 發酵菌株的預處理 將-80 ℃保存的受試菌株以2%的接種量分別接種至MRS 肉湯和TSB培養基中活化，37 ℃，150 r/min 培養18 h，于4 ℃下，8000 r/min，離心5 min。棄去上清液，用生理鹽水進行洗滌，將菌體懸浮，備用。

1.2.3.2 香腸加工配方與工藝 將購買的豬肉按照肥瘦4:1 的比例絞碎成肉餡，每1000 g 豬肉中加入食鹽25 g，白砂糖10 g，硝酸鈉和亞硝酸酸鈉各70 mg，抗壞血酸500 mg，與相應發酵劑（接種量為107CFU/g）充分攪拌后在0～4 ℃條件下腌制24 h。將腌制后的豬肉灌入腸衣中，晾曬于室外，溫度為10～20 ℃，平均相對濕度為65%，自然發酵26 d。

1.2.4 常規理化指標和微生物指標測定方法

1.2.4.1 微生物指標的測定 樣品的處理與菌落總數、疑似乳酸菌和葡萄球菌的計數參考牛茵等[17]的方法。腸桿菌的計數參照《GB 4789.41-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 腸桿菌科檢驗》[18]的檢測方法。將第26 d 的樣品梯度稀釋后注入平板，然后傾倒VRBGA 培養基，混勻，于37 ℃培養48 h后取出計數，得到腸桿菌的數量。

1.2.4.2 pH 的測定 pH 的測定方法參照《GB 5009.237-2016 食品安全國家標準 食品pH 值的測定》[19]的測定方法。測定三次，結果取平均值。

1.2.4.3 水分含量的測定 每份樣品取1 g 肉樣于水分測定盤中，使用HR83 水分含量測定儀進行測定。測定三次，結果取平均值。

1.2.4.4 亞硝酸鹽的測定 參照《GB 5009.33-2016食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[20]。測定三次，結果取平均值。

1.2.4.5 硫代巴比妥酸的測定 參照《GB/T 35252-2017 動植物油脂 2-硫代巴比妥酸值的測定 直接法》[21]。測定三次，結果取平均值。

1.2.4.6 色度值的測定 將樣品均勻攪碎后，平鋪于培養皿中，將樣品表面按壓平整，選取6 個不同部位，使用色差儀進行測定[17]。

1.2.5 發酵香腸揮發性風味物質的測定

1.2.5.1 樣品的處理 取5 g 絞碎混勻的香腸肉樣，裝入20 mL 頂空瓶中，加入10 μL 內標環己酮，用壓蓋器密封，備用。

1.2.5.2 頂空固相微萃取/氣相色譜-質譜分析方法（HS-SPME/GC-MS）HS-SPME 條件：首先將盛裝有樣品的頂空瓶于80 ℃恒溫預孵化10 min，然后用50/30 μm DVB/CAR/PEMS 萃取針于80 ℃條件下萃取30 min，最后將萃取針在進樣口230 ℃解析2 min。

GC 條件：使用TG-WAXMSB 極性色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），不分流模式，進樣口溫度230 ℃，升溫程序：初始柱溫40 ℃，維持3 min，再以5 ℃/min的升溫速率升溫至210 ℃，維持5 min，載氣為氦氣（純度＞99.999%），流速1 mL/min。

MS 條件：接口溫度210 ℃，傳輸線溫度230 ℃，電壓1.2 kV，全掃描模式，質量掃描范圍40～500 m/z，掃描時間2 s，離子源溫度250 ℃，EI 離子源，電子能量70 eV。

1.2.5.3 揮發性風味物質定性定量分析 定性分析：結果由計算機自動檢索（NIST 08）進行定性分析，結合Xcalibur 軟件系統進行手動對照檢索，匹配度（SI）和反匹配度（RSI）要求均大于800，可能性大于80%。通過C7～C40的正構烷烴標準物，按照以下公式計算測定物質的保留指數（retention index，RI）。

式中：RI 為樣品的保留指數；Tx、Tn、Tn+1分別為樣品、正構烷烴Cn、正構烷烴Cn+1的保留時間，min。

定量分析：依據化合物的峰面積比值與含量成正比的原理進行分析，計算公式如下：

式中：C 為測定物質的質量濃度，μg/kg；Ax為測定物質的峰面積，AU·min；C0為內標物（環己酮）濃度，μg/μL；V 為內標物進樣體積，μL；A0為添加的內標物峰面積，AU·min；m 為測定樣品質量，g。

關鍵風味化合物的評定：參照劉登勇等[22]的方法，利用相對氣味活度值（relative odor activity value,ROAV）法確定發酵肉湯中的關鍵揮發性風味物質。公式如下：

式中：OAV 為氣味活度值（odor activity value，OAV）；C 為所測定的揮發性化合物的質量濃度，μg/kg；T 為相同物質的感覺閾值，μg/kg；ROAVi為某組分的相對氣味活度值；OAVi為某組分的氣味活度值，OAVmax為對樣品總體風味貢獻最大的組分的氣味活度值。ROAVi≥1 的組分為所分析樣品的關鍵風味化合物，0.1≤ROAVi＜1 的組分對樣品的總體風味具有重要的修飾作用。

1.2.6 感官評定 參照Chen 等[16]的方法，由9 名訓練有素的研究生組成感官評價小組，以質地、顏色、風味和整體接受度作為評定指標，其中1 表示非常厭惡，5 表示既不喜歡也不厭惡，9 表示非常喜歡，將分數匯總后取平均值。

1.3 數據處理

數據結果以“平均值±標準誤”表示，采用Excel 2019 對不同處理組香腸的風味物質進行數據處理，Origin 2018 作圖；采用SPSS Statistics 22 進行數據分析，利用Duncan 多重比較進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗實驗結果

植物乳桿菌L77 和木糖葡萄球菌S120 的拮抗作用如圖1 所示。從圖中可以看出菌株交叉的部位依舊有菌生長，受試的植物乳桿菌L77 和木糖葡萄球菌S120 之間不存在拮抗作用，可以復配用于香腸發酵。

圖1 植物乳桿菌L77 和木糖葡萄球菌S120 間的拮抗作用Fig.1 Antagonism between Lactiplantibacillus plantarum L77 and Staphylococcus xylosus S120

2.2 不同處理組發酵香腸的常規理化性質和微生物分析

2.2.1 發酵香腸的微生物指標 對發酵26 d 的3 組香腸樣品的疑似乳酸菌數量、疑似葡萄球菌數量、細菌總數、腸桿菌數量進行了測定，結果如表1 所示。

表1 不同發酵香腸的微生物測定結果Table 1 Microbiological results of different fermented sausages

從表1 可以看出，接種了發酵劑的L77 組和L77-S120 組的細菌總數分別為9.01 和9.20 lg CFU/g，顯著高于空白組（P＜0.05），但兩個接菌組之間的細菌總數沒有顯著性差異（P＞0.05）。空白組的乳酸菌數量（7.72 lg CFU/g）、葡萄球菌數量（7.81 lg CFU/g）和細菌總數（8.09 lg CFU/g）均顯著低于接菌組（P＜0.05），但腸桿菌數量（3.66 lg CFU/g）卻顯著高于接菌組（P＜0.05），說明接菌發酵有利于抑制有害菌的生長，這與李珊珊[23]、楊貝等[24]、梁蕊芳等[25]的結果一致。其中，L77 組未接種葡萄球菌，但葡萄球菌數量卻顯著高于空白組（P＜0.05），可能是因為MSA 平板的選擇性較差，測定結果包含葡萄球菌和其他細菌。乳酸菌單菌組（L77）的乳酸菌數量為9.06 lg CFU/g，顯著高于其他兩個組（P＜0.05），復配組（L77-S120）的乳酸菌數量為8.44 lg CFU/g，顯著高于空白組（P＜0.05），說明在添加乳酸菌的發酵香腸中，乳酸菌很快成為優勢菌株，復配組中葡萄球菌與乳酸菌的生長形成競爭，葡萄球菌可能對乳酸菌的生長有一定的抑制作用。

2.2.2 發酵香腸的常規理化指標 乳酸能降低香腸的酸度，不僅能產生一種獨特的乳酸香氣，還能使肉制品中的蛋白質發生變性，從而改善香腸的組織結構、品質和口感。由表2 可知，兩個接菌組的pH 分別為5.81 和5.82，均顯著低于空白組（P＜0.05）。三個組之間的水分含量沒有顯著性差異（P＞0.05），可能是由于這幾個組的香腸均處于同溫度同濕度的通風條件下晾曬，因此失水率并沒有很大的差異。TBARS 值是評價發酵過程中脂質氧化程度是否合適的指標[26]，脂肪氧化會使過氧化合物增多，從而導致香腸的感官質量下降。由表2 可知，L77 組和L77-S120 組的TBARS 值為3.05 和2.51 mg/kg，顯著低于空白對照組（P＜0.05）。可能是由于葡萄球菌和乳酸菌能產生過氧化氫酶，抑制脂肪的進一步氧化[27]。L77-S120 組的TBARS 值又顯著低于乳酸菌單菌組（P＜0.05），說明乳酸菌和葡萄球菌能夠共同促進香腸TBARS 值的降低[27]，由此可見，添加復合發酵劑可以有效抑制香腸的脂質氧化。我國對于發酵肉制品中亞硝酸鹽的殘留量有明確的規定，其中發酵肉制品中亞硝酸鹽的添加量＜150 mg/kg，發酵肉制品中亞硝酸鹽的最后殘留量＜30 mg/kg[28]。由表2 可知，空白組的亞硝酸鹽含量為3.92 mg/kg，顯著高于兩個接菌組，乳酸菌單菌組也顯著高于復配組（P＜0.05），復配組的亞硝酸鹽含量最低。這說明復合發酵可能比單菌發酵更有利于降低香腸中的亞硝酸鹽含量。

表2 不同發酵香腸的常規理化性質測定結果Table 2 Regular physical and chemical properties of different fermented sausages

2.2.3 發酵香腸的色澤變化 香腸的色度由L*、a*、b*三個指標共同決定，L*值為亮度值，與香腸水分含量有關，a*值為紅度值，能反映樣品的偏紅度，b*值為黃度值，脂肪氧化和蛋白質變性都會增大b*[29]。發酵26 d 的香腸樣品中，三個組之間的色度差異如表3 所示。

表3 不同發酵香腸色度測定結果Table 3 Chromaticity determination results of different fermented sausages

由表3 可知，復配組的L*低于空白對照組和乳酸菌單菌組，說明添加復配發酵劑加快了發酵的進行，使水分流失加快，從而導致香腸亮度降低。復配組的a*顯著高于空白組和乳酸菌單菌組（P＜0.05），說明添加葡萄球菌會產生硝酸鹽還原酶會將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，在發酵成熟的過程中，亞硝酸鹽能與肌紅蛋白結合形成一氧化氮肌紅蛋白，使肉色呈現鮮紅色[30]，從而使發酵香腸的a*值增加。乳酸菌單菌組和復配組的b*顯著低于空白組（P＜0.05），這可能是由于接菌發酵抑制了腐敗菌的生長和脂肪氧化。

2.3 不同處理組發酵香腸的主體揮發性風味化合物分析

風味物質對發酵肉制品的風味貢獻作用主要依賴于其濃度和閾值。只通過濃度去評價揮發性風味化合物對風味的貢獻是不全面的。采用ROAV 法篩選出對總體風味起關鍵作用和修飾性作用的物質作為主體風味化合物（ROAV≥0.1），結果如表4 和圖2所示。

表4 不同發酵香腸主體揮發性風味化合物的相對氣味活度值Table 4 Relative odor activity values of main volatile flavor compounds of different fermented sausages

圖2 不同發酵香腸的主體揮發性風味化合物（ROAV≥0.1）的含量Fig.2 Content of main volatile flavor compounds(ROAV≥0.1) of different fermented sausages

從表4 中可以看出，不同組之間主體風味化合物的種類存在差異，L77-S120 組的主體風味化合物的種類最多，其中醛類物質有10 種，醇類3 種，酯類2 種，酸類有1 種，其他類有4 種。L77 組數量次之，醛類物質有7 種，醇類2 種，酯類有1 種，其他類有5 種。空白組數量最少，醛類物質有5 種，醇類3 種，酯類有2 種，其他類有2 種。總體來說，添加發酵劑組的主體風味化合物種類多于空白組，這可能是由于微生物促進了蛋白質、脂肪和糖等成分分解，其中由脂肪分解成的游離脂肪酸和蛋白質分解成的游離氨基酸是重要的風味前體物質，能夠促進風味物質的形成[31]。

圖2 表示了三組發酵香腸產生的主體風味化合物（ROAV≥0.1）的含量。產生的風味化合物主要分為醛類、酸類、醇類、酯類和其他類。

從圖2 中可以看出，在主體揮發性風味化合物的分類中，其他類物質含量最多，酸類僅在L77-S120 組中存在，L77-S120 組主體風味物質的含量最多。這些風味物質主要是由脂質氧化分解、蛋白質降解以及碳水化合物的分解產生[32]。醛類是脂肪降解的典型風味之一[33-34]，由于閾值較低，因此對整體風味的貢獻更為突出，主要來源于油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸的氧化，是發酵香腸中最重要的風味化合物。醇類的閾值較醛類高，對香腸風味影響不大，但醇類是醛酮化合物的前體物質，對風味主要起加成修飾作用。酯類化合物閾值較低，通常具有芳香味，含有短鏈脂肪酸的酯類大多帶有水果香氣，含有長鏈脂肪酸的酯類大多呈現較淡的油脂味[35]。其他類主要包括烷烴、吡嗪類等雜環化合物，烷烴閾值較高，對風味沒有太大的貢獻，吡嗪是糖和游離氨基酸的美拉德反應的產物，具有明顯的烤堅果香[36]。

將主體風味化合物按照油脂香、奶油香、花果香和其他香四種香型進行分類，結果如表5 所示。

表5 不同發酵香腸主體揮發性風味化合物香型及含量（μg/kg）Table 5 Flavor type and content of main volatile flavor compounds of different fermented sausages (μg/kg)

從表5 中可以看出，與不接菌空白組和乳酸菌單菌組（L77）相比，復配發酵組（L77-S120）的油脂香、奶油香和花果香物質的數量與含量均為最多，分別為8 種（1525.5 μg/kg）、2 種（514.09 μg/kg）、7 種（1219.43 μg/kg）。其中，己醛和壬醛顯著低于空白組和L77 組（P＜0.05），庚醛、（E）-2-庚烯醛、蘑菇醇和2-戊基呋喃顯著高于空白組和L77 組（P＜0.05），反-2-辛烯醛、反-2,4-癸二烯醛、反-2-十一烯醛、2-乙基丁酸、癸酸乙酯、戊醛和壬醇僅在復配發酵組檢出。乳酸菌單菌組（L77）的油脂香物質含量最少，為1050.98 μg/kg，可能是由于油脂香主要來源于醛類物質，由脂質自氧化和葡萄球菌的氨基酸代謝產生[37]，例如油酸自氧化形成己醛、庚醛、壬醛和2-十一烯醛，亞油酸自氧化生成戊醛、己醛和2,4-癸二烯醛[38]，加入乳酸菌發酵會抑制脂質氧化，減少油脂香物質的數量和含量。乳酸菌單菌組（L77）不具有奶油香，復配發酵組的奶油香主要由2-乙基丁酸和δ十二內酯決定，這兩種物質分別由氨基酸代謝和脂質代謝產生。乳酸菌單菌組（L77）和不接菌空白組產生花果香的物質種類和含量相近，遠低于復配發酵組（L77-S120）。由此可見，以發酵香腸主體風味化合物的數量、含量及香型特征為指標，使用復配發酵劑（L77-S120）比單菌發酵（L77）和不接菌發酵的香腸在香氣豐富度和香氣類型上更優。

2.4 不同處理組發酵香腸的感官評定結果

表6 為不同處理組發酵香腸的感官評分結果，其中L77 組和L77-S120 組的質地得分為4.83 和4.53，顯著（P＜0.05）高于空白組。L77-S120 組的色澤和風味得分顯著（P＜0.05）高于空白組和L77 組，與揮發性風味化合物的檢測結果一致。對于香腸的整體接受度評分，L77-S120 組得分最高，與另外兩個組具有顯著性差異（P＜0.05）。

表6 不同發酵香腸感官評定結果Table 6 Sensory assessments of different fermented sausages

綜上所述，添加發酵劑對香腸的質地、色澤、風味和整體接受度具有一定的影響，其中發酵劑復配（L77-S120）組優于單菌發酵（L77）組和空白發酵組，感官評分結果顯示，L77-S120 組具有較好的質地、色澤、風味和整體接受度，更適合作為發酵劑進行生產與推廣。

3 結論

本研究以不接菌發酵作為空白對照，通過主體揮發性風味化合物的數量和含量及香型、微生物數量、TBARS 值、亞硝酸鹽含量和感官評定等探究植物乳桿菌和木糖葡萄球菌L77-S120 復配組和L77單菌組對發酵香腸品質和揮發性風味的影響。L77-S120 組的TBARS 值、亞硝酸鹽含量和腸桿菌數量均顯著低于空白組和L77 組（P＜0.05），接種發酵劑會抑制腸桿菌等腐敗菌的生長，L77-S120 組的主體揮發性風味物質含量和數量均高于空白組和L77組，差異風味化合物包括庚醛、（E）-2-庚烯醛、蘑菇醇、2-戊基呋喃、反-2-辛烯醛、反-2,4-癸二烯醛、反-2-十一烯醛、2-乙基丁酸、癸酸乙酯、戊醛和壬醇，復配組的主體風味物質產油脂香、奶油香和花果香的能力高于單菌組和空白組。復配組的感官評價結果也顯示L77-S120 組發酵香腸的綜合品質最好。所以，復配組更適合作為發酵香腸的產香型發酵劑。