葉綠素對葉黃素生物可給率的影響

黃千千，陳麗君，李韻唱，陳雪寒，陳乾睿，王元楷，蔡 甜，陳科偉,4,5,6,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.西南大學食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，重慶 400715；3.西南大學化學化工學院，重慶 400715；4.西南大學中匈食品科學合作中心，重慶 400715；5.川渝共建特色食品重慶市重點實驗室，重慶 400715；6.農業(yè)農村部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（重慶），重慶 400715）

葉黃素廣泛存在于植物中，是一種優(yōu)良的抗氧化劑。人類視網(wǎng)膜中含有大量的葉黃素，可在一定程度上過濾進入人眼視網(wǎng)膜的藍光，有效降低視覺損害[1]，還可以降低老年性黃斑變性的風險[2]。葉黃素結構中的C40 類異戊二烯碳骨架和10 個共軛雙鍵使得葉黃素的溶解度較差，并且對光和氧非常敏感[3]。另外在胃腸道消化過程中也會發(fā)生降解，最終導致葉黃素在腸道中的吸收很少，生物可給率低。考慮到從食物中攝取是獲得葉黃素的唯一來源，因此如何高效補充葉黃素成為研究熱點。目前常采用遞送系統(tǒng)（用脂質體、納米顆粒、乳液、微膠囊等包埋）[4]來提高葉黃素的生物可給率，焦巖等[5]通過納米脂質體的載體作用將葉黃素包囊形成納米結構，改變其疏水性狀態(tài)，能有效提高葉黃素的穩(wěn)定性；王曉[6]采用微膠囊技術，制備高穩(wěn)定性和高生物利用度的負載葉黃素微膠囊。此外，石曉晴等[7]還通過物理包埋和化學改性（如酯化反應）等方法改變劑型，并利用超微粉碎和微囊化等技術將葉黃素制備成油懸浮液、水分散性干粉、微膠囊和脂質體。

在消化過程中有許多因素會影響葉黃素的生物可給率，包括葉黃素本身的物理/化學性質、食物材料的微觀結構、與其他食物成分的相互作用等[8]。研究表明葉黃素與部分食物成分的相互作用可有效防止其氧化降解[9]，如多酚、脂質、膳食纖維等[10]。葉綠素與葉黃素共存于植物的葉綠體中，葉綠素也是一種脂溶性物質且結構多變，其分子由一個卟啉環(huán)和一個脂肪烴側鏈（植醇）組成，卟啉環(huán)的中央含有一個鎂原子[11]。葉綠素本身在光、熱、酸等理化因素下極不穩(wěn)定，易分解或氧化生成不同結構的衍生物，在酸性條件下葉綠素卟啉環(huán)中央的鎂原子容易被氫離子取代生成脫鎂葉綠素，而在堿性或酸性作用下葉綠素容易水解脫去植基變成脫植基葉綠素[12]。高等植物中絕大多數(shù)葉綠素為葉綠素a 和葉綠素b，在酸、熱等過程中會形成脫鎂葉綠素a 和脫鎂葉綠素b，同時在可食用海藻如紫菜、海帶等中還存在大量的不含植醇鏈的葉綠素衍生物，如脫植基葉綠素和脫鎂葉綠酸[13]。目前國內外關于葉綠素與其他脂溶性成分相互作用的研究較少，而大多集中在葉綠素的代謝[14]、脂質的添加對葉綠素降解的作用[15]以及保護葉綠素不被氧化降解的措施[16]等。與葉黃素一樣，葉綠素需要被摻入膠束后才能有效地進行腸吸收[17]，然而關于膳食葉綠素是否影響葉黃素生物利用還知之甚少，因此研究葉綠素及其結構變化對葉黃素生物可給率的影響以及兩者共消化及膠束化過程中產生的相互作用具有重要意義。

本研究制備了8 種膳食中常見的葉綠素及其衍生物（葉綠素a 和b、脫鎂葉綠素a 和b、脫植基葉綠素a 和b、脫鎂葉綠酸a 和b，化學結構見圖1 和表1），利用體外靜態(tài)消化模型及膠束化實驗研究它們對葉黃素生物可給率的影響，為研究如何提高葉黃素的生物利用度提供一定的參考。

表1 8 種常見葉綠素及其衍生物的化學結構Table 1 Chemical structures of eight common chlorophylls and their derivatives

圖1 葉綠素的基本化學結構Fig.1 Fundamental chemical structures of chlorophylls

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮菠菜、成熟酸橙（Citrus×aurantium（Lour.）Engl.）重慶當?shù)厥袌觯婚L壽花金胚玉米油（1 L）山東三星玉米產業(yè)科技有限公司；純品葉黃素（CAS：127-40-2，純度≥90%）上海麥克林生化有限公司；乙醇（分析純）、丙酮（分析純）、無水硫酸鈉（分析純）、鹽酸 重慶川東化工有限公司；N,N-二甲基甲酰胺 萬盛川東化工有限公司；2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）阿拉丁生物化學技術有限公司；乙酸銨、丙酮（色譜純）、甲醇（色譜純）、豬胰腺α-淀粉酶（≥5 U/mg）、豬胰腺胰蛋白酶（4 U/mg）、豬胃粘膜胃蛋白酶（≥250 U/mg）、豬胰腺脂肪酶（≥125 U/mg）、豬膽汁提取物（≥200 U/mg）Sigma-Aldrich（中國上海）；氯化鉀、氯化鈉、碳酸氫鈉 成都科隆化工有限公司。

SPH-200B 恒溫搖床 上海世平實驗設備有限公司；TGL-16M 臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；PB-10 標準型PH 計 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；BSA124S 分析天平 德國Sartorious 公司；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-II 型循環(huán)水真空泵、RE-52AA 旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；DHG-9240A 電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；Agilent 1290 infinity II 超高效液相色譜儀 美國Agilent 公司；XP-DCY-12SL 圓形電動水浴氮吹儀 上海析譜儀器有限公司；DW-HL398超低溫冷凍儲存箱 中科美菱低溫科技股份有限公司；Malvern Zetasizer Nano ZS90 納米粒度電位儀英國馬爾文儀器有限公司；Vortex-2 渦旋混勻儀 上海滬析實業(yè)有限公司；BX53 正置熒光顯微鏡 日本Olympus 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 8 種不同結構葉綠素的制備 參考實驗室已有的方法[18]提取葉綠素并進行一些修改，本實驗中的所有操作均在安裝有綠光燈且避光的實驗室內進行，以避免色素的光降解。將新鮮菠菜葉片洗凈、剪碎并打漿，與等比例的石油醚（30～60 ℃）進行充分混合，用八層紗布過濾，棄去含有葉黃素和少部分葉綠素的第一次濾液，加入等體積的丙酮:乙醇=1:1 混合液提取濾渣中的葉綠素，重復操作直至綠色的菠菜濾渣轉變?yōu)辄S色。再用等體積的乙醚進行復提，經無水硫酸鈉過濾后，通過旋轉蒸發(fā)器在常溫下減壓旋轉揮干乙醚及殘留的水分，最后用少量丙酮溶解并經超聲3 min 后過濾（0.22 μm），即可得到葉綠素原液。將葉綠素原液均勻地點樣于1 mm 厚的濾紙板上，用配比為石油醚（60～90 ℃）:乙醇:甲醇=60:20:1 的層析液洗脫，進行薄層層析。層析產生的藍綠色條帶為葉綠素a，黃綠色條帶為葉綠素b。將來自層析的葉綠素條切割并浸入等體積丙酮中以獲得相應的葉綠素-丙酮溶液。

用植物組織制備的丙酮粉可以實現(xiàn)葉綠素的脫植基化，其中成熟的橙皮具有較高的葉綠素酶活性[18]。取成熟酸橙（C.aurantium（Lour.）Engl.）的外皮并用蒸餾水清洗，瀝干水分后放入-20 ℃冰箱中儲存，使用時將酸橙皮剪碎后進行破碎，加入等比例的冷丙酮（-20 ℃）進行混勻，抽濾去除丙酮并置于通風櫥內晾干，之后將其研磨并用30 目網(wǎng)篩進行過篩，即可得到橙皮丙酮粉。稱取4 g 橙皮丙酮粉用30 mL，5 mmol/L 的PBS（pH7.0，50 mmol/L KCl，0.24% Trition-X-100）提取葉綠素酶，經磁力攪拌器700 r/min 攪拌1 h 后用八層紗布過濾，濾液經離心機5000 r/min 離心8 min 后，取上清液備用。將50 μL，1 μmol/mL 的葉綠素與0.2 mL 酶液以及0.2 mL，0.1 mol/L PBS（pH7.0，50 mmol/L MgCl2）混合并攪拌均勻。將葉綠素b 反應液在搖床上于30 ℃下酶解1 h，將葉綠素a 反應液在搖床上于40 ℃下酶解3 h。反應結束后加入4 倍體積的丙酮終止其反應，反應液用等體積乙醚復提，經無水硫酸鈉除水后，進行常溫旋轉揮干，用少量丙酮溶解，得到的葉綠素丙酮溶液采用紙層析法可制備得到脫植基葉綠素a、b 溶液。

將5 mL，1 μmol/mL 的葉綠素a/b 或脫植基葉綠素a/b 丙酮溶液置于50 mL 離心管中，滴入2～3滴0.1 mol/L 的鹽酸溶液。不斷搖晃觀察到液體顏色由綠變褐后迅速加入純水20 mL，用乙醚復提。向有機相中加入等體積的10%氯化鈉水溶液，洗去有機相中的氫離子，重復3～4 次。將有機相減壓旋轉揮干，并用少量丙酮溶液進行溶解，即可得到脫鎂葉綠素a/b 或脫鎂葉綠酸a/b 溶液。

1.2.2 標準曲線的建立 參考實驗室已有的研究[19]和方法[20]并加以修改，對1.2.1 中所制備的8 種葉綠素溶液的具體濃度進行測定，同時用葉黃素標準品配制摩爾濃度分別為0.01、0.1、1.0 μmol/mL 的葉黃素-乙醇溶液，均采用與光電二極管陣列檢測器相偶聯(lián)的超高效液相色譜法（ultra-high performance liquid phase chromatography-diode array detector，UPLC-DAD），配備有自動進樣系統(tǒng)。分析柱為C18柱（Poroshell 120，1.9 μm，2.1×100 mm），并配有同等材料的保護柱。流動相A 為甲醇:水=8:2 混合液，流動相B 為甲醇:丙酮=1:1 混合液，向兩流動相中分別加入10 mmol/L 乙酸銨，流速為0.2 mL/min。使用梯度洗脫程序：0～15 min，0%～100% B；15～20 min，100% B；20～25 min，0% B。最終根據(jù)保留時間及光譜特征對葉黃素和葉綠素進行定性分析，得到的不同色素濃度的標準曲線方程結果見表2。

表2 不同色素濃度的標準曲線方程Table 2 Standard curve equations for different pigments concentrations

1.2.3 體外靜態(tài)消化 參考標準植物化學物質的體外消化實驗方法[19,21-23]，模擬口腔、胃和腸道三個階段的消化過程，設置三個消化實驗組：葉黃素和葉綠素共消化、葉綠素單獨消化及葉黃素單獨消化。根據(jù)相關研究及人類日常膳食攝入量標準，類胡蘿卜的日均攝入量為14 mg[24]，總葉綠素的日均攝入量為50～65 mg[25]，以此確定葉黃素體外消化的起始濃度為2.5～50 μmol/L，葉綠素的起始濃度應為相應葉黃素的3.5～4.5 倍，最終確定本研究中葉黃素的初始濃度為7.5 μmol/L，而葉綠素的初始濃度為葉黃素的4.2 倍，即31.5 μmol/L，并按照最終消化液體積為10 mL 來計算所需的葉黃素和葉綠素貯備液體積。每組均設置6 次獨立平行實驗。

前處理：分別將葉黃素和不同結構的葉綠素按照比例單獨或共同加到15 mL 樣品管中，進行氮吹晾干后加入50 μL 玉米油，將其在功率為200 W 的超聲波清洗器中超聲10 min。其中玉米油為精煉油，以減少油中含有的少量葉黃素對反應體系的影響。

口腔階段：將0.568 gα-淀粉酶溶于生理鹽水（140 mmol/L NaCl 和5 mmol/L KCl）中，最終體積為25 mL 作為模擬唾液。向每個樣品管中加入750 μL 模擬唾液和6.5 μL，0.3 mmol/L CaCl2溶液，用0.9 mol/L NaHCO3溶液將pH 調至7.0，補加生理鹽水使總體積為2.5 mL，37 ℃恒溫搖床中85 r/min反應2 min。

胃消化階段：將0.496 g 胃蛋白酶溶于生理鹽水（140 mmol/L NaCl 和5 mmol/L KCl）中，最終體積為25 mL 作為模擬胃液。向每個口腔階段消化結束后的樣品管中加入750 μL 模擬胃液和2.5 μL，0.3 mmol/L CaCl2溶液，用5 mmol/L HCl 溶液將pH 調至3.0，補加生理鹽水使總體積為5 mL，37 ℃恒溫搖床中85 r/min 反應2 h。

腸消化階段：將8.333 g 胰蛋白酶、5 g 膽鹽和2.222 g 胰脂肪酶溶于0.1 mol/L NaHCO3溶液中，最終體積為125 mL 作為模擬腸液。首先用0.9 mol/L NaHCO3溶液將pH 調至6.5 以終止胃消化，再向每個胃消化階段結束后的樣品管中加入3.75 mL 模擬腸液和10 μL，0.3 mmol/L CaCl2溶液，之后用0.9 mol/L NaHCO3溶液將pH 調至7.0，補加生理鹽水使總體積為10 mL，其它后續(xù)操作同上。

1.2.4 體外離心共膠束化 體外消化完成后，分別取1 mL 消化液于15、2.5 mL 樣品管，并分別置于-20 ℃（用于色素提取）和4 ℃（用于電位和粒徑檢測）下待用以抑制所有消化酶的作用。另取5 mL 消化液于15 mL 加厚離心管，置于離心機中，在4 ℃、12000 r/min 條件下離心1.5 h。離心完成后用0.2 μm尼龍膜過濾，得到混合膠束，分別取1 mL 膠束液于15、2.5 mL 樣品管，并分別置于-20 ℃（用于色素提取）和4 ℃（用于電位和粒徑檢測）下待用。

1.2.5 從消化液和膠束中提取色素 以消化液為例，向消化液中加入2 mL 飽和食鹽水和2 mL 丙酮（含0.1% BHT），搖勻后加入2 mL 乙醚提取有機相，吸取上層有機相于另一干凈樣品管，重復操作（至少3 次）直至上層有機相變?yōu)闊o色，通過旋轉蒸發(fā)器在常溫下減壓旋轉揮干有機溶劑及殘留水分，最后用1 mL 丙酮溶解粘附在蒸發(fā)瓶上的色素，渦旋2 min后用0.22 μm 尼龍膜過濾，用于超高效液相色譜分析，并根據(jù)1.2.2 中建立的標準曲線對消化液及膠束液中的葉黃素和葉綠素進行定量測定。

1.2.6 Zeta 電位和粒徑的測定 對經過體外消化后消化液和膠束液的粒徑和Zeta 電位進行測定。分別將經體外消化后置于4 ℃下的消化液和膠束液進行樣品制備，采用納米粒度電位儀分別測定Zeta 電位和平均粒徑，使用純水作為分散體系，折射率為1.33。每個樣品進行6 次獨立重復測定。

1.2.7 熒光顯微鏡觀察消化液和膠束液形貌 葉綠素會吸收短波長的激發(fā)光，發(fā)射出更大波長的光作為熒光[26]，據(jù)此可以利用葉綠素熒光的特性，將與葉黃素共消化或單獨消化后葉綠素在消化液和膠束液中的分布可視化。參考實驗室已有的方法[19,21]并加以改進，將葉綠素與葉黃素共消化或單獨消化后的少量消化液和膠束液分別均勻地涂布在載玻片上，用蓋玻片覆蓋。使用的激發(fā)射線波長為633 nm，收集的發(fā)射熒光波長范圍為650～700 nm[27]，用正置熒光顯微鏡以10×的放大率在熒光模式下觀察樣品。每個樣品進行3 次獨立重復測定。

1.2.8 消化特性指標的計算 體外消化特性指標的相關計算如下：

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究利用超高效液相色譜配備的Bruker Compass Data Analysis 5.1 數(shù)據(jù)處理軟件對體外消化前后不同結構的葉綠素及其衍生物和葉黃素進行定性定量分析，采用Origin 2022 軟件對數(shù)據(jù)進行繪圖，運用SPSS 26.0 統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05 表示具有顯著性差異。每組數(shù)據(jù)均進行6 次獨立平行實驗，最終結果表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 體外消化過程中葉黃素和葉綠素各項指標的變化

2.1.1 回收率分析 回收率能夠反映體外消化后葉黃素和葉綠素被消化降解為無色物質而損失的程度[21]，圖2（A）為葉黃素的回收率，其中葉黃素單獨消化時的回收率最低（51.91%），與不同結構葉綠素共消化時葉黃素的回收率均升高，且與單獨消化時相比具有顯著差異（P＜0.05），說明不同結構葉綠素均能對葉黃素的消化損失起到一定的抑制作用。其中脫鎂葉綠素b 對葉黃素的保護作用最強，兩者共消化時葉黃素的回收率高達90.48%，而脫植基葉綠素a 對葉黃素的保護作用最弱（71.60%）。圖2（B）為葉綠素及其衍生物的回收率，其中脫鎂葉綠素a 組在單獨消化及與葉黃素共消化時的回收率均最大，分別為91.67%和85.45%。初始投入葉綠素a、b 進行消化，最終葉綠素b 組的回收率總體上高于葉綠素a 組，與之前的研究結果相一致[23]，這是因為在結構上葉綠素 b 中 C7 位上的-CHO 比葉綠素 a 中的 -CH3更有助于穩(wěn)定葉綠素的卟啉結構[21]。

圖2 體外消化后葉黃素和葉綠素及其衍生物的回收率Fig.2 Recovery rate of lutein,chlorophylls and their derivatives after in vitro digestion

2.1.2 膠束化率分析 混合膠束由膽鹽和脂肪消化產物等形成[28]，膠束化率是評價脂溶性化合物能被腸上皮細胞吸收的有效指標[21]。圖3（A）為葉黃素的膠束化率，葉黃素單獨消化時的膠束化率可達83.27%，這是因為葉黃素本身的極性較大，很容易通過脂滴表面進入小腸內與膽鹽等其他物質形成混合膠束[29]。在共消化時，脫鎂葉綠素a、脫植基葉綠素b 以及脫鎂葉綠酸a 均使葉黃素的膠束化率降低，可能原因是這三種葉綠素與葉黃素在膠束化過程中發(fā)生復合形成了致密的結構而導致葉黃素膠束化率降低[21]。而其他結構的葉綠素則使葉黃素的膠束化率升高，其中脫鎂葉綠酸b 所對應的葉黃素膠束化率最大，為89.80%。圖3（B）為葉綠素及其衍生物的膠束化率，脫鎂葉綠酸b 組在單獨消化及與葉黃素共消化時均呈現(xiàn)出最大的膠束化率，分別為96.16%和86.64%，且兩者間具有顯著性差異（P＜0.05）。脫鎂葉綠酸a 組的膠束化率總體上低于脫鎂葉綠酸b 組，與先前的研究[17,21]不一致，可能是受到食物基質及消化環(huán)境條件等的影響。大部分結構的葉綠素在總體上均呈現(xiàn)b 系列比a 系列更利于膠束化，這與之前的研究結果[19]相一致，可能原因是b 系列葉綠素具有能增強親水性的甲酰基[19]。脫植基葉綠素a、b 組和脫鎂葉綠酸a、b 組的膠束化率總體上比葉綠素a、b 組和脫鎂葉綠素a、b 組高，即無植醇鏈葉綠素的膠束化率較含植醇鏈葉綠素的高，這是因為植醇的存在能夠影響膠束化過程，并且極性葉綠素比非極性葉綠素優(yōu)先膠束化和被吸收[17]。另外，葉綠素a、b 組的膠束化率與脫鎂葉綠素a、b 組的差異不大，可能是因為中心鎂的存在與否對摻入膠束的影響并不顯著[17]。

圖3 體外消化后葉黃素和葉綠素及其衍生物的膠束化率Fig.3 Micellization rate of lutein,chlorophylls and their derivatives after in vitro digestion

2.1.3 生物可給率分析 生物可給率是對營養(yǎng)物質在攝入后能夠被吸收利用程度的綜合評價，可用來評估消化期間從食物基質轉移到膠束的攝入化合物的量[23]。圖4（A）為葉黃素的生物可給率，可知葉黃素單獨消化時其生物可給率最小（42.83%），與不同結構葉綠素共消化時的葉黃素生物可給率均增大，且兩者之間均具有顯著差異（P＜0.05），說明不同結構的葉綠素均能提高葉黃素的生物利用程度。其中脫鎂葉綠素b 與葉黃素共消化時所對應的葉黃素生物可給率最大，為80.44%。結合葉黃素的回收率（圖2A）和膠束化率（圖3A）可知，在確定葉黃素生物可給率方面的主導因素是回收率，這是因為相比于膠束化過程，葉綠素能更多地在消化過程中保護葉黃素不被破壞。圖4（B）為葉綠素及其衍生物的生物可給率，可知與葉黃素共消化時葉綠素組的生物可給率均更低，可能原因是葉黃素從食物基質中釋放進入胃腸環(huán)境后，被油脂包埋其中，必須將表層脂質水解才能使葉黃素暴露[10]，而在與葉綠素共消化時，葉綠素的脂溶性特性能抑制其表層脂質水解以減少葉黃素的暴露及消解，同時葉綠素還具有一定的抗氧化性[30]，在消化過程中可抑制葉黃素被氧化，從而提高葉黃素在體內的生物可給率。其中單獨消化時脫植基葉綠素b 組的生物可給率最大，為64.40%；與葉黃素共消化時脫鎂葉綠酸b 組的生物可給率最大，為52.65%。b 系列葉綠素的生物可給率均比a 系列的大，是因為b 系列葉綠素在總體上具有更大的膠束化率，而生物可給率會受到膠束化過程的影響。另外，在總體上呈現(xiàn)出無植醇鏈葉綠素（脫植基葉綠素a 和b 組、脫鎂葉綠酸a 和b 組）的生物可給率較含植醇鏈葉綠素（葉綠素a 和b 組、脫鎂葉綠素a 和b 組）的高，這與葉綠素膠束化率（圖3B）的趨勢一致，可能原因是葉綠素的脫植醇反應可顯著提高其膠束化能力，從而進一步提高體外消化過程中的生物可給率[18]。

圖4 體外消化后葉黃素和葉綠素及其衍生物的生物可給率Fig.4 Bioaccessibility index of lutein,chlorophylls and their derivatives after in vitro digestion

2.2 葉綠素及其衍生物在體外消化過程中的組成變化

表3 為單獨消化或與葉黃素共消化前后葉綠素及其衍生物的組成變化。葉黃素在體外消化前后的結構未發(fā)生變化，而葉綠素在食品加工和其他條件下容易發(fā)生氧化，形成各種葉綠素氧化產物，如132-羥基衍生物和151-羥基內酯衍生物等[31]，在本研究中這兩類葉綠素氧化產物均能被檢測到，這與體外消化過程中的氧化環(huán)境有關[23]。胃中的酸性條件會將葉綠素a 和葉綠素b 分別轉化為脫鎂葉綠素a 和脫鎂葉綠素b，而玉米油對此具有一定的保護作用，會抑制部分葉綠素發(fā)生轉化[23]。同時與單獨消化相比，葉黃素共消化時葉綠素能更多地轉化為脫鎂葉綠素，這是因為在消化過程中葉黃素較葉綠素更加穩(wěn)定，兩者共存時葉綠素的結構會優(yōu)先發(fā)生變化，說明共消化時葉綠素在一定程度上能為葉黃素提供保護作用。另外相比于葉綠素b 組，葉綠素a 組在消化過程中能更多地轉變?yōu)槊撴V葉綠素，并且先前的研究也表明在相同的消化時間內葉綠素a 轉化為脫鎂葉綠素的速度比葉綠素b 快[23]。脫鎂葉綠素a、b 組在消化前后均未轉變?yōu)槠渌Y構的葉綠素，只在自身內部發(fā)生結構變化。先前研究發(fā)現(xiàn)脫鎂葉綠素的植基鏈可以水解形成脫鎂葉綠酸[21,23]，而在本研究中并未發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，可能原因是食物基質玉米油會對脫鎂葉綠素的水解起到一定的抑制作用。在胃酸的作用下，脫植基葉綠素可以轉化為脫鎂葉綠酸[17]，本研究中發(fā)現(xiàn)脫植基葉綠素a、b 組中均有這樣的變化。有研究表明氧化的葉綠素衍生物具有更高的膠束化率，并且羥基的增加有助于提高其在膠束中的溶解度[32]，本研究中脫鎂葉綠素a 和b 組、脫植基葉綠素a 和b 組以及脫鎂葉綠酸b 組中均具有這樣的趨勢，與葉黃素共消化相比，它們單獨消化后能產生更多的132-羥基衍生物或151-羥基內酯衍生物（表3），所對應的膠束化率（圖3B）也在單獨消化時比與葉黃素共消化時更高。

表3 消化前后葉綠素及其衍生物的組成含量變化（%）Table 3 Changes in the composition contents of chlorophylls and their derivatives before and after digestion (%)

2.3 消化液和膠束液的體外消化特性

消化液和膠束液中顆粒的平均粒徑、熒光圖像及Zeta 電位見圖5。如圖5（A）所示，消化液中顆粒的平均粒徑為587.17～995.82 nm，膠束液顆粒的平均粒徑為220.17～577.68 nm，可見消化液顆粒的平均粒徑更大，說明消化液經過膠束化處理變成膠束液的過程會使溶液中的顆粒變小，可能是因為膠束化過程需經過高速離心處理，造成顆粒分散，而顆粒大小是決定微納米顆粒乳液穩(wěn)定性的一個重要因素[33]，因此顆粒小的膠束液具有更好的穩(wěn)定性和乳化能力[34]。同時，如圖5（C）所示，消化液和膠束液的Zeta 電位均為負值，且膠束液的Zeta 電位絕對值普遍是大于消化液的，而Zeta 電位的絕對值能代表懸浮液的穩(wěn)定性，絕對值越大，穩(wěn)定性就越好[35]，因此說明膠束液的穩(wěn)定性比消化液的更好。此外，圖5（A）中脫鎂葉綠酸a 的平均粒徑比脫鎂葉綠素a 小，這是因為脫鎂葉綠酸a 缺乏植醇導致分子尺寸減小[17]。對于消化液，共消化后的平均粒徑總體上大于單獨消化時的平均粒徑，說明大部分結構的葉綠素在消化過程中能與葉黃素形成復合物，而部分葉綠素在與葉黃素共消化時的平均粒徑減小，可能是因為受到食物基質或其他消化成分的影響；對于膠束液，總體上呈現(xiàn)葉綠素單獨消化時的平均粒徑更大，可能是因為相比于單獨消化，葉綠素在與葉黃素共消化時自身更多地被分解，膠束化過程通過高速離心將兩者分離，從而得到體積更小的色素顆粒。葉綠素具有熒光特性，會在一定程度上受到同處在一起的高極性葉黃素的調節(jié)[11]。以脫鎂葉綠酸b 為代表，圖5（B）為其單獨消化及與葉黃素共消化后在消化液和膠束液中分布的熒光圖像，能直觀反映葉綠素顆粒在消化液及膠束液中的分布和數(shù)量。在熒光模式下，可以看到消化液顆粒（a、b 圖）的形狀和數(shù)量均比膠束液顆粒（c、d 圖）的更大更多，并且葉綠素與葉黃素共消化后的消化液和膠束液顆粒（b、d 圖）均明顯大于葉綠素單獨消化時的（a、c 圖），這與A 圖中脫鎂葉綠酸b 平均粒徑的變化相一致。

圖5 消化液和膠束液中顆粒的平均粒徑（A）、熒光圖像（B）及Zeta 電位（C）Fig.5 Average particle size (A),fluorescence images (B) and Zeta potential (C) of the particles in the digestive and micellar solutions

3 結論

本研究通過制備8 種不同結構的葉綠素，并與葉黃素共同或單獨進行體外消化及膠束化實驗，探究不同結構葉綠素對葉黃素生物可給率的影響規(guī)律。結果表明，在消化過程中不同結構的葉綠素均會對葉黃素產生一定程度的保護作用。通過體外消化過程中葉黃素和葉綠素各項指標的變化發(fā)現(xiàn)，相比于葉黃素單獨消化，在與所有結構葉綠素共消化時葉黃素的回收率和生物可給率均能顯著升高（P＜0.05），其中脫鎂葉綠素b 在與葉黃素共消化時所對應的葉黃素回收率和生物可給率均為最大（90.48%和80.44%），說明脫鎂葉綠素b 在消化過程中對葉黃素的保護效果最佳。在本實驗中，未發(fā)現(xiàn)葉黃素結構的變化，而葉綠素結構發(fā)生了變化，這與自身分子的化學性質有關，還會受到食物基質、環(huán)境條件等其他因素的影響。由消化液和膠束液中顆粒的平均粒徑、熒光圖像以及Zeta 電位值可以確定膠束液體系比消化液體系更加穩(wěn)定，同時葉綠素能通過與葉黃素形成復合物來提高葉黃素的生物可給率。本研究為葉黃素的生物利用增效提供了一定的參考，同時不同結構的葉綠素在與葉黃素相互作用的同時，也會受到其他因素的影響，如膳食成分、消化條件及其它脂溶性植物化學物質（如固醇）等，這些影響機制還有待進一步研究。