基于多光譜技術分析綠原酸與肌原纖維蛋白相互作用的初步研究

李 杰，郭 欣,2,3，袁天帥，屈啟超，朱新榮,2,3, ，張 建,2,3,

（1.石河子大學食品學院，新疆石河子 832003；2.農業(yè)農村部特色農產(chǎn)品加工與質量安全控制重點實驗室（部省共建），石河子大學食品學院，新疆石河子 832003；3.食品營養(yǎng)與安全控制兵團重點實驗室，石河子大學食品學院，新疆石河子 832003）

多酚是植物體內的次生代謝產(chǎn)物，含多個酚羥基結構，主要來源于水果、蔬菜和中草藥[1]。多酚是天然的抗氧化劑，在食品貯藏保鮮上起到延緩脂質/蛋白質氧化，提高食品品質的作用，通常以功能添加成分用于食品加工。目前已有研究報道，植物多酚能替代合成的抗氧化劑添加到肉類食品中，減少營養(yǎng)物質的損失，延長貨架期[2-3]。

多酚與蛋白質具有良好的親和性，能通過共價或非共價相互作用形成復合物，改變蛋白質的空間結構，優(yōu)化蛋白功能性質，進而提升產(chǎn)品感官特性和經(jīng)濟價值。例如，茶黃素、綠原酸和飛燕草素-3-O-葡萄糖苷影響β-乳球蛋白的二級和三級結構；在中性條件下，低濃度茶多酚可以提高蛋清蛋白的抗氧化活性和乳化性能；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin Gallate，EGCG）Results 原 酸（Chlorogenic Acid，CA）能降低大豆7S 蛋白敏化的程度[4-6]。此外，乳清分離蛋白與EGCG，槲皮素，芹菜素和柚皮素的共價作用可提升蛋白抗氧化力；豌豆分離蛋白與EGCG，CA 和白藜蘆醇的非共價相互作用可提升蛋白的乳化性、起泡性以及消化率等功能性質；乳鐵蛋白-單寧配合物能增加蛋白的泡沫穩(wěn)定性[7-9]。

肌原纖維蛋白（Myofibrillar Protein，MP）是組成肌肉中肌原纖維的主要蛋白質，約占肌肉總蛋白的50%～60%，通常作為衡量肌肉品質的主要指標，也對蛋白質產(chǎn)品的乳化、起泡、凝膠性質起著至關重要的作用。已有研究報道多酚在氧化條件下對肌原纖維蛋白具有延緩蛋白質降解、保護蛋白質結構，以及提高蛋白質凝膠性等影響[10-11]。然而，多酚與肌原纖維蛋白的相互作用通過多光譜學技術分析不同濃度多酚-蛋白的結合對蛋白質結構變化，以及采用熱力學技術分析多酚-蛋白相互作用力的探索鮮有系統(tǒng)研究。

因此，本文以高白鮭MP 為研究對象，通過與不同濃度CA 的相互作用，探究多酚-蛋白復合物的總巰基含量，表面疏水性的理化性質；傅里葉紅外光譜，三維熒光光譜探究蛋白質二級、三級結構變化；最后通過同步熒光光譜，紫外光譜等多光譜學技術并結合熱力學變化分析多酚-蛋白質的結合能力情況，闡明水溶性多酚CA 與高白鮭MP 的結合性質，旨在為多酚與肌原纖維蛋白相互作用提供有價值的信息，為后續(xù)不同結構多酚-高白鮭肌球蛋白的凝膠特性變化及作用機制奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮高白鮭（Coregonus peled）新疆溫泉縣賽湖漁業(yè)技術開發(fā)有限公司提供；綠原酸（純度＞98%）上海源葉生物科技有限公司；5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）、三羥甲基氨基甲烷（Trihydroxymethyl Aminomethane，Tris）、溴化鉀 北京博奧拓達科技有限公司；氯化鉀、氯化鈉、乙二胺四乙酸（Ethylenediamine Tetraacetic Acid，EDTA）、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鈉、1-苯胺基萘-8-磺酸、尿素 天津永晟精細化工有限公司；鹽酸 北京化工廠；以上試劑均為分析純。

T-3200 紫外分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；F-4700 熒光分光光度計 日本日立公司；970CRT 熒光分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司；NicoletiS10 傅里葉遠紅外光譜儀、Thermo Multifuge XIR 冷凍高速離心機 美國賽默飛世爾科技公司；1X71 多功能酶標儀 美國博騰儀器有限公司；HX-10-50B 真空冷凍干燥機 上海喬楓實業(yè)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肌原纖維蛋白的提取 參考Guo 等[12]方法略調整。采用10 倍體積去離子水（4 ℃預冷）與魚肉背部肌肉混合于10000 r/min 均質30 s。勻漿4 ℃離心10 min（8000 r/min）后取沉淀，沉淀與10 倍體積0.3% NaCl 溶液混合重復上述步驟一次。再次取沉淀與4 倍體積的20 mmol/L Tris-HCl 提取液（含0.6 mol/L NaCl，pH7.0）混合，4 ℃下浸提1 h，使肌原纖維蛋白充分溶解。2 層紗布過濾，收集濾液。濾液用預冷去離子水以1:4（v:v）比例稀釋，4 ℃離心10 min（8000 r/min）取沉淀。加入20 mmol/L 的PBS 緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH7.0）重新溶解沉淀，并用1 層紗布過濾，濾液即為肌原纖維蛋白溶液。蛋白濃度采用雙縮脲法進行測定。

1.2.2 綠原酸（CA）與肌原纖維蛋白的孵育 將1.2.1 制備的肌原纖維蛋白溶液采用20 mmol/L 的PBS 緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH7.0）稀釋至10 mg/mL；用相同PBS 緩沖液制備10 mmol/L CA 母液，分別加入等體積的不同濃度CA 溶液，使其終濃度為6、30、150 和300 μmol/g，25 ℃反應2 h，以未加多酚的蛋白加入相同體積PBS，作為空白對照（以每克肌原纖維蛋白含量為基準計算，調整CA 濃度，以下實驗方法中，CA 濃度均如此確定）。

1.2.3 總巰基含量測定 參考 Liu 等[13]方法并做調整，測定按1.2.2 條件制備的CA 終濃度分別為6、30、150 和300 μmol/g 肌原纖維蛋白樣品的總巰基含量。用20 mmol/L PBS 緩沖液分別將以上樣品液稀釋至1 mg/mL。取1 mL 蛋白樣品，加入4 mL 50 mmol/L 的緩沖液（含0.6 mol/L KCl，10 mmol/L EDTA，8 mmol/L 尿素，pH7.0）。取4 mL 上述混合液，加入0.4 mL 的0.2 mmol/L 的5，5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸），充分混勻后40 ℃反應25 min（水浴），412 nm 處測定吸光度。以20 mmol/L 的PBS 緩沖液作為空白對照。

式中：R，總巰基含量，μmol/g；A，吸光度；B，蛋白質的質量濃度，mg/mL；C，摩爾吸光系數(shù)13.6，mol·cm/mL；D，稀釋倍數(shù)。

1.2.4 表面疏水性測定 參考Pessato 等[14]的方法使用1-苯胺基萘-8-磺酸（ANS）測定按1.2.2 制備的蛋白樣品（添加CA 終濃度分別為6、30、150 和300 μmol/g）的表面疏水性。將樣品的蛋白質濃度分別稀釋至0.05～0.2 mg/mL。將20 μL 8 mmol/L ANS（10 mmol/L 磷酸緩沖液中，pH7.0）與4 mL 蛋白質樣品混合。混合物置于黑暗中保持2 min。在390 nm 激發(fā)波長和470 nm 發(fā)射波長下記錄熒光強度。通過計算熒光強度值對蛋白質濃度的初始斜率，獲得樣品的表面疏水性。

1.2.5 傅里葉紅外變換光譜（FTIR）參照吳黎明等[15]的方法。將按1.2.2 制備的蛋白樣品（添加CA 終濃度分別為6、30、150 和300 μmol/g）在4 ℃去離子水中透析，反復更換透析液。透析12 h后，樣品冷凍過夜，后續(xù)用真空冷凍干燥機進行冷凍干燥。樣品與溴化鉀以1:100 比例進行研磨，壓片。以溴化鉀為背景，掃描波段為400～4000 cm-1，用Peak fit 軟件進行分析。

1.2.6 同步熒光光譜的測定 參考王志軍等[16]的方法，利用970CRT 熒光分光光度計對按1.2.2 制備的蛋白樣品（添加CA 終濃度分別為6、30、150 和300 μmol/g）進行測定。用20 mmol/L 的PBS 緩沖液將樣品稀釋至0.4 mg/mL。分別在波長差 Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm 下記錄樣品的同步熒光光譜。

1.2.7 三維熒光光譜的測定 參考Guo 等[11]的方法測定按1.2.2 制備的蛋白樣品（添加CA 終濃度分別為6、30、150 和300 μmol/g）。樣品采用20 mmol/L PBS 緩沖液分別稀釋至0.1 mg/mL 后，利用F-4700熒光光度計測定，記錄200～500 nm 波段的熒光光譜。

1.2.8 紫外吸收光譜的測定 將按1.2.2 制備的蛋白樣品（添加CA 終濃度分別為6、30、150 和300 μmol/g）分別用PBS 緩沖液（20 mmol/L）稀釋至1 mg/mL，記錄200～700 nm 波段樣品的紫外吸收光譜。

1.2.9 熒光猝滅及熱力學分析測定 參考李改霞等[17]的方法測定。熱力學分析采用溫度段為25～45 ℃，而高濃度多酚在較高溫度下，會加速蛋白沉淀，測試效果極差；同時為保證熒光猝滅數(shù)據(jù)曲線擬合的精度，本實驗選擇小范圍內的多酚終濃度（0、20、40、60、80、100、120、140、160 μmol/g CA）進行掃描熒光光譜。樣品用20 mmol/L 的PBS 緩沖液稀釋至0.4 mg/mL，分別加入等體積不同濃度CA（終濃度為0～160 μmol/g），分別在25、35、45 ℃反應2 min。利用970CRT 熒光分光光度計，在激發(fā)波長λex=280 nm，狹縫5 nm，記錄300～450 nm 波段數(shù)據(jù)。

利用Stern-Volmer 方程計算分析動態(tài)和靜態(tài)猝滅機制：

式中：F0，初始熒光強度；F，添加的猝滅劑的熒光強度；Kq，淬滅速率常數(shù)；τ0，沒有任何猝滅劑的生物分子的平均熒光壽命（τ0=10-8s）；Ksv，淬火常數(shù)；[Q]，淬滅劑的濃度。

利用雙對數(shù)方程計算結合常數(shù)（Ka）和結合位點的數(shù)量（n），分析靜態(tài)猝滅。計算方程如下：

通過Van’t Hoff 公式可計算蛋白質和多酚在結合過程中相關的熱力學參數(shù)[18]。獲得相應溫度（25、35、45 ℃）下的焓變（ΔH）、熵變（ΔS）和吉布斯自由能變化（ΔG）。

式中：T，絕對溫度；Ka，相對溫度下的結合常數(shù)；R，氣體常數(shù)8.314，J/（mol·K）。

通過上述公式（2）～（5）計算確定蛋白質-多酚體系中的主要作用力的類型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對不同批次制備的新鮮樣品分別重復三次實驗，數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差（SD）表示。用SPSS 25.0 進行方差分析，以考慮平均值之間的顯著性水平（P＜0.05），并用Origin 8.5 構建圖形。

2 結果與分析

2.1 綠原酸對肌原纖維蛋白總巰基含量的影響

蛋白質氨基酸側鏈基團如果發(fā)生變化，通常可通過總巰基含量的改變得到印證。如圖1 所示，相比對照組，依次添加不同濃度CA，蛋白質總巰基含量分別下降2.99%，10.93%，17.30%，25.65%，結果表明總巰基含量隨CA 濃度呈劑量依賴性下降，且均與對照組呈顯著差異（P＜0.05）。為防止巰基轉化為二硫鍵，排除因二硫鍵的生成而導致巰基含量下降，在反應試劑中添加了尿素阻斷此反應。因此，結果表明巰基含量下降的主要原因是CA 與蛋白的相互作用。CA 具有5 個羥基，可以通過多酚羥基與蛋白質巰基基團形成分子間氫鍵[19]。此外，本實驗在大氣環(huán)境中進行，故不可避免的發(fā)生氧化作用。酚類物質在反應過程中易被氧化成不穩(wěn)定的醌類物質，進而與巰基發(fā)生加成反應，形成硫醇-醌加成產(chǎn)物，導致巰基含量進一步降低[20]。與Cheng 等[21]研究結果相似，桑葚多酚中的蘆丁，槲皮素以及咖啡酸均會降低肌原纖維蛋白的總巰基含量。

圖1 綠原酸對肌原纖維蛋白總巰基含量的影響Fig.1 Effect of chlorogenic acid on total sulfhydral content of myofibrillar protein

2.2 表面疏水性分析

外源性熒光探針ANS 可以反映疏水位點的表面暴露和蛋白質構象的變化。如圖2 所示，與對照相比，添加6、30 μmol/g CA 后，蛋白質表面疏水性分別下降2.28%和8.26%，有下降趨勢但不顯著。進一步添加150、300 μmol/g CA，蛋白表面疏水性顯著下降31.66%和40.26%（P＜0.05）。一方面，多酚可通過疏水相互作用與蛋白質結合，降低表面疏水性。另一方面，具有酚羥基結構的多酚與蛋白質結合時，引入額外的羥基會增加蛋白質的親水環(huán)境，阻礙ANS 的激發(fā)，并降低其熒光強度。此外，有研究發(fā)現(xiàn)多酚物質會與熒光探針ANS 競爭與蛋白質芳香環(huán)上的疏水性氨基酸側鏈基團結合位點[22]。Jiang等[23]從疏水性層面的探究推斷CA 影響乳清分離蛋白的表面疏水性比酪蛋白表面疏水性更劇烈，其原因是由于乳清分離蛋白對CA 具有更多的結合位點，因此導致乳清分離蛋白的表面疏水性下降程度更高。胡云鵬[24]研究表示少量多酚誘導蛋白解折疊，暴露內部疏水基團，引起表面疏水性的增加；但疏水基團的持續(xù)暴露會使蛋白質之間產(chǎn)生疏水相互作用而聚集，導致疏水基團的屏蔽，因此外源性熒光探針無法結合。本結果與上述學者研究類似，隨著CA 濃度的增加，蛋白質表面疏水性顯著下降，CA 與蛋白的相互作用減少了熒光探針與蛋白的結合機率。同時由后續(xù)的FTIR 結果也可證實蛋白隨CA 的增加而展開，持續(xù)性的疏水作用可能導致蛋白質聚集而掩蓋疏水基團。

圖2 綠原酸對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.2 Effect of chlorogenic acid on surface hydrophobicity of myofibrillar protein

2.3 綠原酸對肌原纖維蛋白二級結構的影響

圖3 為不同濃度CA 作用于蛋白質的紅外吸收光譜譜圖以及解譜后得到的二級結構含量圖。其中圖3（a）顯示了特征峰強度的變化，1500～1600 cm-1為酰胺Ⅱ帶，主要與蛋白的C-N 拉伸振動以及NH 彎曲振動有關；1600～1700 cm-1為酰胺Ⅰ帶，主要與C=O 伸縮振動有關。酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶無明顯的波段位移，但在峰強度上有很明顯的變化，說明CA 影響分子間相互作用[25]。

圖3 綠原酸對肌原纖維蛋白二級結構的影響Fig.3 Effect of chlorogenic acid on secondary structure of myofibrillar protein

酰胺Ⅰ帶對蛋白質結構變化較為敏感，廣泛用于蛋白質二級結構變化研究。通過Peak Fit 對酰胺Ⅰ帶（1600～1700 cm-1）的解譜。如圖3（b）所示，隨著升高CA 濃度，相較于對照組，蛋白質的二級結構含量發(fā)生變化。尤其是添加30、150、300 μmol/g CA分別使α-螺旋結構含量顯著降低28.80%，29.85%和28.85%，而β-折疊含量顯著增加28.07%，30.33%和27.92%（P＜0.05）。蛋白質α-螺旋結構可向β-折疊轉化，這通常是蛋白質分子變性和展開的結果[26]。β-轉角含量顯著上升（P＜0.05），無規(guī)卷曲含量降低，但相較α-螺旋變化可忽略。本研究結果中，α-螺旋含量的降低表明蛋白的二級結構在CA 作用下由有序轉變?yōu)闊o序狀態(tài)。Huang 等[27]研究與本研究結果相似，肌原纖維蛋白α-螺旋含量與迷迭香酸、鼠尾草酸和鼠尾草酚劑量呈負相關。三種多酚均對蛋白質的二級結構產(chǎn)生影響，此外多酚中羥基的數(shù)量與其結合能力相關。

2.4 同步熒光分析

蛋白質的構象變化也可采用同步熒光研究分析。通常根據(jù)蛋白質的同步熒光譜中，色氨酸（波長差Δλ為60 nm）和酪氨酸殘基（波長差Δλ為15 nm）的光譜信息來推斷蛋白質構象的變化[28]。

如圖4 所示，對照組中色氨酸的熒光強度為594.18，酪氨酸的熒光強度為334.63，這表明蛋白質的熒光強度主要來源于色氨酸。當添加CA 后，熒光強度隨CA 濃度呈濃度依賴式降低。當CA 濃度為300 μmol/g 時，與對照組相比，樣品蛋白質中色氨酸與酪氨酸的熒光強度分別降低了80.20%和72.30%。此結果表明CA 對色氨酸的猝滅效果強于酪氨酸，意味著色氨酸在CA 與MP 的相互作用中起著關鍵作用。此外，色氨酸發(fā)生紅移，酪氨酸發(fā)生藍移，表明CA 對MP 熒光存在猝滅作用，且蛋白質色氨酸殘基周圍微環(huán)境發(fā)生變化，親水性增加，而酪氨酸殘基周圍微環(huán)境疏水性增加，蛋白質構象發(fā)生變化。溫鶴迪等[29]在卵白蛋白與CA 復合物研究表明色氨酸與酪氨酸微環(huán)境均向疏水環(huán)境變化，且色氨酸猝滅強度大于酪氨酸，由此判斷色氨酸殘基位置更接近于蛋白-多酚的結合位點。與本研究的氨基酸殘基微環(huán)境變化結果不符的原因，可能是蛋白質種類或多酚的濃度不同導致。

圖4 綠原酸對肌原纖維蛋白同步熒光光譜的影響Fig.4 Effect of chlorogenic acid on synchronous flurescence spectra of myofibrillar protein

2.5 三維熒光分析

三維熒光光譜可反映全部熒光特征信息。Peak 1 主要與酪氨酸和色氨酸的殘基的光譜行為有關，Peak 2 主要與多肽鏈結構的變化有關[30]。圖5 結果表明，隨著CA 濃度的上升，酪氨酸和色氨酸的熒光強度依次減小。同時，Peak 2 峰的峰面積與熒光強度降低，說明CA 改變了MP 的蛋白結構。由FTIR 結果顯示，蛋白質結構隨CA 濃度的增加而逐漸展開，這會暴露蛋白內部的疏水基團。在進一步高含量的多酚存在下，可能通過疏水作用結合，從而導致了熒光強度的降低[31]。此結果與上述的同步熒光和二級結構結果可相互印證。Sui 等[32]研究大豆蛋白與花青素的共價與非共價相互作用時，三維熒光光譜中的Peak 1 特征峰顏色顯著變淺，Peak 2 區(qū)域變小甚至消失，這表明色氨酸和酪氨酸殘基被消耗或屏蔽。同時，與非共價相互作用形成的復合物相比，共價作用能使花青素與色氨酸和酪氨酸殘基結合表現(xiàn)出更強的熒光猝滅。此外，膳食姜黃素喂養(yǎng)的鴨肉肌原纖維蛋白，其蛋白的三維熒光光譜Peak 1 峰熒光強度隨姜黃素含量的增加而下降[33]。以上研究均表明多酚對蛋白質的熒光強度及肽鏈結構具有猝滅和展開作用。

圖5 綠原酸對肌原纖維蛋白三維熒光光譜的影響Fig.5 Effect of chlorogenic acid on three-dimensional fluorescence spectrum of myofibrillar protein

2.6 綠原酸對肌原纖維蛋白紫外光譜的影響

紫外-可見吸收光譜在一定程度上可反映蛋白質與小分子化合物的相互作用。圖6 為MP 與CA 在不同濃度下的紫外吸收光譜。MP 在280 nm 附近具有顯著的紫外吸收峰（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的特征吸收）。多酚的加入增加了蛋白質在280 nm 處的吸收值，表明埋在蛋白質內部的芳香氨基酸被暴露出來，即氨基酸微環(huán)境或蛋白結構在蛋白質與多酚結合時發(fā)生變化。同時，觀察到在280 nm 附近的吸收峰在CA 存在的情況下顯示出顯著的紅移（從277.5 nm 到284.8 nm），表明結合位點的極性在與多酚結合時發(fā)生了改變。值得注意的是，在超過150 μmol/g 的CA 濃度下產(chǎn)生了一個新的紫外吸收峰，這可能是CA 本身的吸收峰，并且新峰出現(xiàn)的位置與多酚結構有關。Xu 等[4]在β-乳球蛋白與三種多酚相互作用的研究中發(fā)現(xiàn)，β-乳球蛋白-茶黃素系統(tǒng)的紫外光譜譜圖中，在370 nm 和470 nm 處出現(xiàn)新的吸收峰；而在β-乳球蛋白-綠原酸系統(tǒng)的紫外譜圖中，342 nm 處出現(xiàn)新峰。此結果與本研究結果類似。動態(tài)猝滅并不改變物質的吸收光譜，只影響熒光分子的激發(fā)態(tài)，而靜態(tài)猝滅會改變熒光分子的吸收光譜（復合物的形成）[34]。基于以上，可以推斷MP-CA之間的猝滅機制是靜態(tài)猝滅。

圖6 綠原酸對肌原纖維蛋白紫外光譜的影響Fig.6 Effect of chlorogenic acid on ultraviolet absorption spectral of myofibrillar protein

2.7 熒光猝滅與熱力學分析

將 CA 加入到MP 溶液后，二者之間會形成MPCA 復合物而導致蛋白自身的熒光強度的降低，即熒光猝滅[35]。熒光猝滅主要有兩種類型：靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅。猝滅劑與熒光團發(fā)生擴散和碰撞而導致的稱為動態(tài)猝滅；靜態(tài)猝滅則是兩者之間形成了基態(tài)復合物[36]。通常，可依據(jù)擴散碰撞速率常數(shù)Kq來判斷熒光猝滅的類型，當Kq＞2.0×1010L/mol/s 時，為靜態(tài)猝滅；反之則為動態(tài)猝滅。

為了闡明猝滅機制，MP-CA 的Stern-Volmer 曲線及其數(shù)據(jù)如圖7 和表1 所示。根據(jù)Stern-Volmer方程，F(xiàn)0/F 與多酚濃度的曲線顯示出良好的線性關系（R2＞0.9）。Kq值（4.008～4.582×1012L/mol/s）大于猝滅常數(shù)2.0×1010L/mol/s。乳清蛋白和綠原酸、EGCG 與扇貝性腺分離蛋白的結合也有類似的結果[37-38]。

表1 不同溫度下CA-MP 反應的熒光猝滅參數(shù)Table 1 Fluorescence quenching parameters of CA-MP reaction at different temperature

圖7 綠原酸對肌原纖維蛋白熒光猝滅的影響Fig.7 Effect of chlorogenic acid on fluorescence quenching of myofibrillar protein

采用雙對數(shù)曲線方程分析靜態(tài)猝滅數(shù)據(jù)，可獲得結合常數(shù)（Ka）和結合位點數(shù)（n），結果見表1。在本研究中，三個溫度條件下的n 值均接近1，這意味著MP 上可能有一個酚類化合物的單一結合位點。Ka的值大于104L/mol/s 表明對多酚的親和力很高。此外，Ka隨著溫度的變化而增加，這表明MPCA 復合物的形成變得更加有利，并且復合物的穩(wěn)定性增加，這是疏水相互作用的特征[39]。這與以下熱力學參數(shù)結果一致。

多酚-蛋白質復合物的相互作用力包括氫鍵、范德華力、疏水作用等，ΔH、ΔS 的正負值可用于判斷復合物之間的相互作用力的類型。當ΔH＜0，而ΔS＞0 時，則靜電相互作為主導作用力；當ΔH＜0，ΔS＜0 時，則氫鍵和范德華力作為主導作用力；而當ΔH＞0，ΔS＞0 時，則疏水作用作為主導作用力[40]。如表1 所示，ΔG 均為負數(shù)，表明此結合是自發(fā)反應，且ΔH＞0，ΔS＞0，可知MP-CA 結合的相互作用力主要為疏水作用力。許多研究表明，多酚和蛋白質主要通過疏水相互作用、氫鍵和范德華力結合[41]。由于羥基的存在，蛋白質和多酚之間的氫鍵相互作用也是可能的。已有研究發(fā)現(xiàn)，豌豆蛋白和EGCG 通過氫鍵和范德華力相互作用，但花生蛋白與CA 主要通過靜電相互作用形成復合物[8]。本文中的這種不一致性可能歸因于不同蛋白質的復雜結構。

3 結論

綠原酸與高白鮭肌原纖維蛋白的相互作用會改變蛋白活性基團含量與結構構象，造成蛋白側鏈氨基酸活性基團的損耗以及蛋白結構展開。在長期暴露蛋白內部疏水性的基礎上，30～300 μmol/g 綠原酸的羥基與蛋白相互作用，屏蔽蛋白表面疏水性。多光譜學技術驗證了綠原酸與肌原纖維蛋白通過疏水相互作用結合，在靜態(tài)猝滅下產(chǎn)生復合物，且色氨酸殘基距離相互作用位點更近。本研究通過多光譜學技術結合熱力學分析推斷綠原酸-肌原纖維蛋白的結合性質，為分子層面的模擬提供理論依據(jù)，也為后續(xù)研究不同結構多酚-肌球蛋白相互作用機制提供研究基礎。