超高效液相色譜串聯線性離子阱質譜法檢測減肥類產品中N-丁基-3-（三氟甲基）-α-甲基苯乙胺*

方 韻，賈昌平，張 萍，張 斌△

（1. 江蘇省蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州 215000； 2. 安徽省蕪湖市食品藥品檢驗中心，安徽 蕪湖 241006）

隨著社會的發展，越來越多的人關注健康，減肥類產品也愈加受關注［1-2］，但其中非法添加藥物成分的情況也較常見。目前，市場上減肥類中成藥及（保?。┦称分刑砑拥倪`禁成分主要有芬氟拉明、西布曲明等［3-4］。芬氟拉明化學名為N-乙基-α-甲基-3-三氟甲基苯乙胺，屬苯丙胺類食欲抑制劑［5］，不合理使用可能引起心臟瓣膜疾病、神經系統損傷、急性腎衰竭等［4，6-7］。國家法定檢驗標準（如《國家食品藥品監督管理局藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目》）均已收載芬氟拉明的檢測方法，并列為禁用成分。N- 丁基- 3 -（三氟甲基）-α- 甲基苯乙胺（C14H20F3N）為芬氟拉明的修飾物，也需防止其出現在減肥類產品中。目前尚未見常用方法［8-11］檢測N-丁基-3-（三氟甲基）-α-甲基苯乙胺的報道。鑒于此，本課題組擬建立超高效液相色譜串聯線性離子阱質譜法檢測減肥類產品中非法添加的該成分，以為相關產品的監管提供技術支撐?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 30A 型超高效液相色譜儀，含二極管陣列檢測器（日本Shimadzu 公司）；ABSCIEX QTRAP?6500 +線性離子阱質譜儀（美國AB SCIEX 公司）；KQ - 300 DA 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q 純水系統（美國Millipore 公司）；XS205DU 型電子天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為0.1 mg）。

1.2 試藥

N-丁基-3-（三氟甲基）-α-甲基苯乙胺對照品（加拿大TRC 公司，批號為5 - TJS - 159 - 2，含量100%）；甲醇和甲酸均為質譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。減肥類產品樣品（10 批，包括中成藥2 批，保健食品7 批，食品1 批，均為蘇州市藥品檢驗檢測研究中心抽樣所得，批號依次為170518，不詳，170602，不詳，181102，不詳，20210502，19079890，150402，171029，記為樣品A-J）。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC?HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm）；流動相為0.1%甲酸溶液（A）-0.1%甲酸水溶液-甲醇（B），梯度洗脫（0～1 min 時30%B，10～10.2 min 時75%B →95%B，12～12.2 min時95%B →30%B）；流速為0.3 mL/min；檢測波長為215 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為1μL。

質譜條件：電噴霧電離離子源、正離子模式（ESI+）；脫溶劑氣為氮氣（N2）；去溶劑氣溫度為550 ℃；監測模式為正離子模式；離子化電壓為5 500 V；噴霧氣壓力（Gas1）為55 psi；輔助加熱氣壓力（Gas2）為55 psi；多反應監測模式（MRM）、二級質譜（MS2）采集模式；氣簾氣壓25 psi；碰撞氣為Medium?；衔镫x子對參數：母離子m/z260.2，去簇電壓60 V，MRM 離子對m/z260.2/187.1及260.2/159.1（定量離子對），碰撞電壓20，25，30 V，MS2碎片m/z187.1，159.1，109.1，74.1，57.2。

2.2 溶液制備

取N- 丁基- 3 -（三氟甲基）-α- 甲基苯乙胺對照品約10 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配成質量濃度約為100 μg / mL 的對照品貯備液；取適量，用甲醇逐級稀釋，配成質量濃度約為10 ng / mL 的對照品溶液。取一次服用量的樣品，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加甲醇70 mL，渦旋1 min，室溫水浴超聲（功率300 W，頻率40 kHz）提取30 min，放冷至室溫，加甲醇定容，混勻，13 000 r/ min離心5 min，取上清液，即得陽性、陰性供試品溶液。以甲醇為空白對照品。

2.3 質譜行為分析

取2.2 項下對照品溶液及供試品溶液，采用超高效液相色譜串聯線性離子阱質譜法進行定性篩查，按2.1 項下試驗條件進樣測定，采集空白對照品、供試品和對照品色譜圖，如出現與對照品保留時間一致的色譜峰，且紫外吸收光譜均一致，其質譜一級母離子和二級主要子離子質量數均相同，主要子離子的相對豐度比接近（相對離子豐度≤10%，＞10%～20%，＞20%～50%，＞50%時，允許的最大偏差分別為± 50%，±30%，±25%，±20%）。以上要求若同時滿足，則確定樣品中添加了N-丁基-3-（三氟甲基）-α-甲基苯乙胺，利用MRM 模式建立標準曲線進行含量測定；任意一條不滿足，則確定未添加N- 丁基- 3 -（三氟甲基）-α-甲基苯乙胺。

2.4 方法學考察

系統適用性試驗及專屬性試驗：取2.2 項下對照品溶液、陽性供試品溶液、空白對照品溶液各適量，按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄色譜圖。結果陽性供試品溶液色譜圖中，與對照品溶液色譜中各成分峰保留時間一致，峰形良好，且空白對照無干擾。詳見圖1、圖2。

圖1 超高效液相色譜圖1.N -｛1 -［3 -（Trifluoromethyl）phenyl］- 2 - propanyl｝- 1 - butanamineA.Reference solution B.Positive test solution C.Negative test solutionFig.1 UPLC chromatograms

圖2 MRM色譜圖（m/z 260.2/187.1）1.N -｛1 -［3 -（Trifluoromethyl）phenyl］- 2 - propanyl｝- 1 - butanamineA.Reference solution B.Positive test solution C.Negative test solutionFig.2 MRM chromatograms（m / z 260.2 / 187.1）

線性關系考察：精密吸取2.2 項下的對照品貯備液適量，加甲醇稀釋，配制成質量濃度分別為0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，50.0 ng / mL 的系列對照品溶液，按2.1 項下試驗條件進樣測定，采集質譜數據，以質量濃度（X，ng / mL）為橫坐標、MRM 定量離子對峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y= 933 619X+ 108 875（r= 1.000 0，n= 6）。結果顯示，N- 丁基- 3 -（三氟甲基）-α- 甲基苯乙胺質量濃度在0.1～50 ng / mL 范圍內與定量離子對峰面積線性關系良好。

檢測限與定量限考察：精密吸取對照品溶液適量，用甲醇溶液稀釋10 倍后按2.1 項下試驗條件進樣測定，以信噪比為3 和10 時對應的質量濃度為檢測限和定量限，結果分別為0.40 ng/g和1.20 ng/g。

精密度試驗：取對照品溶液適量，按2.1 項下試驗條件連續進樣測定6 次，記錄質譜數據，計算待測成分的色譜保留時間和定量離子對峰面積。結果的RSD分別為0.12%和0.80%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取對照品溶液適量，置自動進樣器中（15 ℃），分別于0，2，4，8，12，24 h 時按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄質譜數據計算定量離子對的峰面積。結果的RSD為2.26%（n= 6），表明對照品溶液15 ℃下放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取陽性樣品（樣品C）1 粒，共6 份，按2.2 項下方法制備陽性供試品溶液，按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄質譜數據，計算待測成分的母離子峰面積。結果的RSD為2.80%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取陰性樣品（樣品J）1粒，置100 mL 容量瓶中，加入對照品貯備液（稀釋成100 ng/ mL）1，5，10 mL，各平行3 份，再加甲醇70 mL，按2.2 項下方法制備陰性供試品溶液，按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄質譜數據，計算離子對峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n = 9）

2.5 樣品含量測定

取10 批樣品各適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液（均平行2 份），與對照品溶液按2.1 項下試驗條件進樣測定。結果1 批樣品（樣品C）供試品溶液色譜中，在與對照品溶液中N-丁基-3-（三氟甲基）-α-甲基苯乙胺峰保留時間一致處對應的總離子流（TIC）圖、MRM圖、MS2碎片均一致，且二級主要碎片的豐度比滿足規定（見圖3至圖5）。最終確定了樣品C中含有N-丁基-3-（三氟甲基）-α-甲基苯乙胺，含量為41.6 mg/g。

圖3 總離子流色譜圖1.N -｛1 -［3 -（Trifluoromethyl）phenyl］- 2 - propanyl｝- 1 -butanamineA.Reference solution B.Positive test solutionFig.3 Total ion chromatograms

圖4 MS2質譜圖（CE：20 V）A.Reference solution B.Positive test solutionFig.4 MS2 spectra（CE：20 V）

圖5 MS2質譜圖（CE：30 V）A.Reference solution B.Positive test solutionFig.5 MS2 spectra（CE：30 V）

3 討論

3.1 研究背景

隨著社會的發展，以及人們對自身健康的關注度越來越高，減肥類中成藥及保健食品中非法添加物質層出不窮，且越來越隱秘。本研究中的檢出物與現行檢驗標準（BJS 201701）中收錄的西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明取代基均僅有微小差異。其次，本研究中同時檢出有一定減肥作用的O-雙去乙?；壬晨舌ぁ⑵蛰谅鍫?、利多卡因［12-14］。N-丁基-3-（三氟甲基）-α-甲基苯乙胺和芬氟拉明的骨架相同，差異在于側鏈取代基由乙基換成了丁基，又在減肥保健食品中發現，推測新檢出的化合物可能是一種新的非法添加物，且尚無明確的檢測手段，可能成為不法分子逃避監管的新手段，亟須新的檢測方法填補漏洞。否則，隨著該物質的使用增多，不僅會影響人民健康，還會對目前的監管質量造成沖擊。

3.2 流動相選擇和優化

預試驗中考察了甲醇、乙腈作為有機相時化合物的色譜分離及質譜響應，發現待測物質譜響應良好，有機相的變化影響較小。由于使用乙腈時液相系統單向閥易造成黏連，故選擇甲醇作為有機相。另外，還考察了甲酸、乙酸作為流動相添加劑對檢測的影響，結果變化不大，所以選擇0.1%甲酸溶液。

3.3 質譜條件選擇

本研究中采用的相關質譜儀器，可在實施MRM 模式的同時，采集化合物的二級質譜，增加了定性的準確度。并可采用單因素試驗優化去溶劑氣溫度、離子化電壓、噴霧氣壓力、輔助加熱器壓力、去簇電壓、碰撞電壓等質譜條件參數，以使質譜信號最佳。

3.4 方法評價

本研究中建立了定性、定量檢測新的非法添加物N-丁基-3-（三氟甲基）-α-甲基苯乙胺的超高效液相色譜串聯線性離子阱質譜法。通過比對色譜峰保留時間、一級質譜母離子、二級主要碎片離子進行定性確證，同時采用MRM模式建立外標法測定含量，可實現準確、快速、靈敏地完成樣品的檢測。但要注意，本方法采用的儀器靈敏度高，而造假樣品中添加物的含量大，因此，樣品前處理時需適當增加樣品稀釋倍數，避免儀器污染。此外，該方法雖然用的是離子阱質譜，但與普通的四極桿質譜儀基本原理相同，后期監管檢測中若用到本試驗中所建立的方法，微調分析參數，即可使用。