3 種中藥成分對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響*

樓彩霞，王 弋，代路路，龍淑嫻，黃小瓊

（1. 廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 佛山 528248； 2. 廣東省人民醫(yī)院·廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 廣州 510080）

中醫(yī)理論認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化（AS）屬本虛標(biāo)實(shí)之血瘀、痰濁范疇，治療應(yīng)以補(bǔ)益肝腎、健脾益氣、滋陰養(yǎng)血、活血化瘀、祛痰降濁為主。中藥姜黃能行氣破瘀、通經(jīng)止痛，連翹能清熱解毒、散結(jié)消癰，虎杖能活血散瘀、祛風(fēng)除濕，均能用于AS的治療。過氧化物酶體增生物激活受體γ（PPARγ）可通過抑制血管平滑肌細(xì)胞中Toll樣受體4（TLR4）介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，改善血管內(nèi)膜增生［1］，PPARγ激動(dòng)劑對(duì)AS具有防護(hù)作用［2］。中藥有效成分姜黃素［3］、連翹苷［4］和白藜蘆醇［5］均具有PPARγ 激動(dòng)作用。且姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抑制淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、延緩細(xì)胞衰老等多種生物學(xué)功能［6-9］；連翹苷廣泛用于治療發(fā)熱、病毒性感冒、淋病、潰瘍等疾?。?］；白藜蘆醇具有抗炎、抗氧化、抗糖尿病和心肌保護(hù)等作用［5］。氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）已被證明參與了AS 的形成過程，其誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷是AS 早期發(fā)病機(jī)制之一。AS 始于內(nèi)皮的炎性變化，內(nèi)皮功能障礙是心血管疾病的前兆，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞是AS的治療策略。自噬在多種類型細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)維持中起重要作用?；诖耍狙芯恐刑接懥私S素、連翹苷、白藜蘆醇對(duì)Ox - LDL 干預(yù)下人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAEC）的增殖、相關(guān)自噬、炎性因子表達(dá)的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細(xì)胞

儀器：Step One 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）儀（美國ABI 公司）；JS-680A 型自動(dòng)凝膠圖像分析儀（上海培清科技有限公司）；SKG - 01 型電熱恒溫干燥箱（湖北省黃石市醫(yī)療器械廠）；GL - 3250A 型磁力攪拌器、LX-100 手掌型離心機(jī)（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；YXQ - LS - 30SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；Ultra Pure UF 型純水系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）；Flexa-200型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（杭州奧盛儀器有限公司）。

試藥：姜黃素（貨號(hào)CAS 458 - 37 - 7，批號(hào)為MB2147，含量≥97%），連翹苷（貨號(hào)CAS 487-41-2，批號(hào)為A0426AS，含量＞98%），白藜蘆醇（貨號(hào)CAS 501-36-0，批號(hào)為M03018，含量≥97%），均購自大連美侖生物科技有限公司；PriMed-iCell-002 原代內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（賽百慷＜上海＞生物科技有限公司，批號(hào)為2022032901）；Ox - LDL 檢測(cè)試劑盒（廣州奕源生物科技有限公司，批號(hào)為20220323）；二甲基亞砜（DMSO，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)為67 - 68 - 5）；Maxima TMSYBRGreen/ ROXq PCR Master Mix（2X）（批號(hào)為#A25742），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)為K1622），均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；總RNA 提取試劑盒（美國Promega 公司，批號(hào)為LS1040）；Marker 1（廣州東盛生物科技有限公司，批號(hào)為M1081）；其余試劑均為分析純，水為純化水。

細(xì)胞：（永生化）iCell - 0015a HAEC（免疫熒光鑒定，賽百慷＜上海＞生物科技有限公司）。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)與分組：收集對(duì)數(shù)生長期的HAEC，以3×103個(gè)/ 孔均勻接種至96 孔板中。每孔體積100 μL。置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組（等體積基礎(chǔ)培養(yǎng)液），溶劑對(duì)照組（等體積含DMSO 的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，DMSO 體積分?jǐn)?shù)＜0.1%），Ox - LDL 組（20μg/mL Ox-LDL），姜黃素①②③④組（20μg/mL Ox - LDL + 2.5 μmol / L、5 μmol / L、10 μmol / L、20 μmol / L 姜黃素），連翹苷①②③④組（20 μg / mL Ox - LDL + 10 μmol / L、20 μmol / L、40 μmol / L、80 μmol / L 連翹苷），白藜蘆醇①②③組（20 μg / mL Ox-LDL+20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L 白藜蘆醇）。除空白對(duì)照組外，其余各組細(xì)胞以含DMSO（體積分?jǐn)?shù)＜0.1%）的基礎(chǔ)培養(yǎng)液及相應(yīng)藥液分別培養(yǎng)48 h。

細(xì)胞增殖情況：采用四甲基偶氮噻唑鹽（MTT）法。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，吸去上清液。每孔加入培養(yǎng)液180 μL，再加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，培養(yǎng)4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL DMSO，低速振蕩10 min。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定490 nm 波長處的吸光度值（A）。細(xì)胞增殖率（%）=（A給藥組-A空白對(duì)照組）/（A溶劑對(duì)照組-A空白對(duì)照組）×100%。

細(xì)胞相關(guān)蛋白mRNA 表達(dá)水平：收集對(duì)數(shù)生長期的HAEC，以5× 104個(gè)/孔均勻接種至12 孔板中，每孔1.5 mL。置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，按分組加入不同濃度的相應(yīng)藥物，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。給藥48 h后，提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行qPCR，測(cè)定微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）和環(huán)氧合酶2（COX-2）的mRNA 表達(dá)水平。每組做3個(gè)復(fù)孔，取平均值。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖情況

與Ox-LDL 組比較，姜黃素、白藜蘆醇各劑量組及連翹苷④組細(xì)胞增殖率顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。詳見圖1。

圖1 細(xì)胞增殖活性A.Curcumin B.Phillyrin C.ResveratrolNote：Compared with that in the Ox - LDL group，*P ＜0.05，**P ＜0.01.Fig.1 Cell proliferation

2.2 LC3 和COX-2 mRNA 表達(dá)水平

與Ox-LDL組比較，姜黃素③組，連翹苷②③④組，白藜蘆醇各劑量組細(xì)胞LC3 mRNA 表達(dá)水平均顯著升高，COX - 2 mRNA 表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01 或P＜0.05）。因姜黃素①④組及連翹苷①組細(xì)胞復(fù)孔間細(xì)胞數(shù)量差異大或未收集到足夠檢測(cè)所需細(xì)胞，故未能檢測(cè)出LC3和COX-2 mRNA。詳見圖2。

圖2 LC3和COX-2 mRNA表達(dá)水平A.LC3 B.COX - 2Fig.2 Expression levels of LC3 and COX - 2 mRNA

3 討論

Ox - LDL 是AS 的危險(xiǎn)因素，能損傷內(nèi)皮細(xì)胞、誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬功能障礙，促進(jìn)AS 的發(fā)生和發(fā)展［10］。內(nèi)皮細(xì)胞在維持血管穩(wěn)態(tài)中起重要作用。內(nèi)皮功能障礙是心腦血管疾病及其他血管系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因。自噬是溶酶體的降解過程，通過移除廢棄的多余蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，在細(xì)胞的生命過程中起重要作用，是細(xì)胞的自我保護(hù)行為。激活有益的自噬是心血管疾病治療的關(guān)鍵。有益的自噬可通過誘導(dǎo)受損細(xì)胞器的降解為細(xì)胞提供能量和營養(yǎng)，保護(hù)心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，并穩(wěn)定AS 斑塊［11］。氧化應(yīng)激會(huì)引起過量自噬而導(dǎo)致疾病狀態(tài)。LC3 是重要的自噬標(biāo)記物，并用于跟蹤自噬體的形成。血管慢性炎癥是AS 過程中的主要病理改變。COX - 2 是與AS 疾病相關(guān)的血管炎癥重要的分子指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，姜黃素、白藜蘆醇各劑量組及連翹苷④組細(xì)胞增殖率顯著降低；姜黃素③組及連翹苷②③④組，白藜蘆醇各劑量組細(xì)胞LC3 mRNA表達(dá)水平均顯著升高，COX - 2 mRNA 表達(dá)水平均顯著降低。該結(jié)果與下述文獻(xiàn)部分結(jié)論趨勢(shì)大致相同：姜黃素可抑制HeLa 細(xì)胞誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖［12］，抑制缺氧誘導(dǎo)的恒河猴視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖［13］，抑制血管新生內(nèi)膜過度增生［14］，降低內(nèi)皮脂毒性并調(diào)節(jié)自噬［15］，減弱腫瘤細(xì)胞活力和抑制其增殖［16］，減少凋亡內(nèi)皮細(xì)胞和降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平［17］，抑制微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成［18］等；連翹苷可減小ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜粥樣斑塊面積［19］，減少腫瘤體積和腫瘤組織密度［20］，改善肥胖癥模型氧化應(yīng)激和脂代謝紊亂［21］等；白藜蘆醇可抑制高糖條件下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖［22］，減輕糖化低密度脂蛋白對(duì)HUVEC 的炎性損傷［23］，缺血和再灌注期間保護(hù)心臟［24］等。

需要說明的是，本研究中中藥成分對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響存在與已有的部分文獻(xiàn)報(bào)道趨勢(shì)不一致的情況。分析原因：1）中藥成分在發(fā)揮療效的同時(shí)，可能也伴隨一定的毒性。兩者與中藥來源、批號(hào)、純度和劑量等均相關(guān)。2）本研究中使用了助溶劑（如DMSO）溶解中藥成分，為避免其對(duì)細(xì)胞生長的影響，將DMSO 體積分?jǐn)?shù)控制在0.1%以下。部分中藥成分在溶解后的稀釋過程中，可能會(huì)有沉淀析出，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在一定影響。3）部分中藥有顏色，本研究中雖已盡量排除藥物顏色對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，但可能還不能完全排除。另外，本研究中僅選取了幾個(gè)有代表性的指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，后期需加大樣本量，增加檢測(cè)指標(biāo)，進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

基于目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步判斷，姜黃素、連翹苷和白藜蘆醇可抑制Ox - LDL 干預(yù)下HAEC 細(xì)胞的增殖，可激發(fā)受損細(xì)胞自噬，抑制炎性因子COX-2表達(dá)。