人血清涎液化糖鏈抗原磁微粒化學發(fā)光免疫分析方法的建立及對肺癌的診斷價值

張少華，杜文水

1 南京華銀醫(yī)學檢驗所 （江蘇南京 211100）； 2 徐州市銅山區(qū)中醫(yī)院 （江蘇徐州221116）

肺Ⅱ型上皮細胞能夠分泌一種特殊的涎液化糖鏈抗原（sialylated carbohydrate antigen，KL-6），KL-6 是一類相對分子質(zhì)量接近200 kDa 的糖蛋白[1]。Peng 等[2]研究表明，機體內(nèi)的KL-6 主要由肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌，肺泡Ⅱ型上皮細胞出現(xiàn)增殖、受激發(fā)等可引發(fā)肺泡細胞受損 ，因此，可以推斷KL-6 水平與肺泡損傷直接相關，可作為臨床評價肺部疾病的重要指標之一[3-8]。血清腫瘤標志物是目前臨床開展最為廣泛、最簡便的腫瘤各期的篩查指標，其中肺癌神經(jīng)元特異度烯醇化酶（neuron specific eno1ase，NSE）、鱗狀上皮細胞癌抗原（squamous cell carcinoma，SCC）、細胞角蛋白19（cytokeratin-19-fragment，CYFRA21-1） 及 血 清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）等為用于肺癌篩查的常用指標。但上述指標對肺癌診斷的特異度、靈敏度欠佳，故對肺癌的診斷不具有特異性。基于此，本研究以磁微粒化學發(fā)光免疫術作為技術支撐，建立血清KL-6 的檢測方法，旨在探討其在肺癌中的診斷價值，并與NSE、SCC、CEA、CYFRA21-1 進行聯(lián)合檢測，以期為肺癌的診斷提供靈敏度指標，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2023 年1—5 月徐州市銅山區(qū)中醫(yī)院收治的85 例肺癌患者為試驗組，其中男44 例，女41 例；年齡19～70 歲，中位年齡38（31，46）歲。對照組為隨機選取同期體檢中心接受健康體檢的健康人群85 名，其中男40 名，女45 名；年齡19～70 歲，中位年齡38（31，46）歲。試驗組納入標準：均經(jīng)手術、穿刺活檢等組織病理學檢查結果確診為肺癌；均行CT 和高分辨率CT 掃描；未伴隨其他惡性腫瘤；臨床資料和影像資料完整。試驗組排除標準：有既往放化療史；伴有其他肺部疾病。本研究經(jīng)徐州市銅山區(qū)中醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過（倫理審批號：202301304）均于檢查前簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

受檢者入組時剔除溶血、黃疸、脂血等標本，采集空腹靜脈血，置入4 ℃ 冰箱中恒溫保存。KL-6 抗體-ALP、KL-6 抗體-磁性顆粒、重組KL-6 抗原均購自天津（梅迪賽斯）生物科技有限公司。采用磁微粒全自動化學發(fā)光免疫分析儀（天津博奧賽斯公司，Axceed 260 型）檢測 NSE、SCC、CEA、CYFRA21-1 水平，檢測方法為化學發(fā)光免疫法，所用試劑為Axceed 260 型檢測儀配套試劑，檢測過程嚴格依據(jù)說明書。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 精密度檢測

依據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）所制定臨床評價方案5（evaluation protocols 5，EP 5）標準指南[9]文件進行精密度實驗，選取高值和低值質(zhì)控品和4 個濃度不同的血清樣本，在同一實驗內(nèi)重復測定2 次，間隔2 h 以上記錄數(shù)據(jù)。同時根據(jù)EP5 中的A3 文件標準計算重復性（SR）、實驗室精密度（SWL）。

1.3.2 檢測范圍線性驗證

參照EP 6指南[10]，選取線性范圍（50～10 000 U/ml）內(nèi)患者的低值樣本和高值樣本，配制11 組梯度樣本，重復測定2 次。已達到設定要求條件基礎上以多項式回歸分析計算重復性，分別完成一次多項式擬合、二次多項式擬合、三次多項式擬合。KL-6 檢測可接受線性允許誤差關系范圍為8.0%，可接受重復性設定范圍≤6.0%。

1.3.3 檢測限

參照EP17[11]標準指南文件確定KL-6 的空白限LoB）：空白樣本測定結果第95 百分位數(shù)秩號對應濃度結果為LoB），檢出限LoD：濃度范圍LoB 值1～5 倍范圍內(nèi)的低濃度樣本，第50 百分位數(shù)秩號對應的濃度為LoD），每天重復測定4 次，連續(xù)測定3 d，低濃度樣本結果確保低于LoB 的百分比＜5%。選用2 批不同批次試劑進行實驗測定并計算LoB、LoD，比較2 批試劑計算結果，較大值為最終LoB、LoD 值。

1.3.4 評價標準

NSE＞15.2 ng/ml 為陽性[5]、SCC＞1.7 ng/ml 為陽性[6]、CEA＞5.0 ng/ml 為陽性[7]、CYFRA21-1＞3.3 ng/ml 為陽性[8]、KL-6 ≥500 U/ml 為陽性[9]。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，采用t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。診斷效能評價使用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算曲線下面積（area under curve，AUC），根據(jù)AUC結果評價血清標志物檢測診斷的靈敏度和特異度。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 KL-6 精密度測定結果

不同濃度精密度檢測結果均值、SD、SR、SWL見表1。本產(chǎn)品的重復性變異系數(shù)（CV%）＜6.0%（2.4%～3.3%），實驗室內(nèi)精密度CV%＜8.0%（4.3%～6.0%）。

表1 KL-6 精密度測定結果

2.2 KL-6 檢測線性范圍

線性范圍結果見表2，SDr為2.6%，＜實驗室設定允許范圍5%。多項式回歸分析顯示，二次多項式非線性系數(shù)與三次多項式的非線性系數(shù)與一次擬合系數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明預期值與測量值間相關性良好，相關系數(shù)r=0.996。磁微粒化學發(fā)光法檢測KL-6 在50～10 000 U/ml 范圍內(nèi)成良好的線性，經(jīng)計算KL-6 檢測限指標LoB為20 U/ml，LoD 為50 U/ml。

圖1 KL-6 梯度濃度預測值與實測值的線性分析圖

表2 KL-6 線性范圍檢測結果

2.3 KL-6 在肺癌診斷中的應用

2.3.1 試驗組和對照組血清KL-6、NSE、SCC、CEA、CYFRA21-1 水平比較

試驗組血清KL-6、NSE、CEA、CYFRA21-1 水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；試驗組SCC 水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 試驗組和對照組血清KL-6、NSE、SCC、CEA、CYFRA21-1 水平比較 （±s）

表3 試驗組和對照組血清KL-6、NSE、SCC、CEA、CYFRA21-1 水平比較 （±s）

注：KL-6 為涎液化糖鏈抗原，NSE 為神經(jīng)元特異度烯醇化酶，SCC 為鱗狀上皮細胞癌抗原，CEA 為血清癌胚抗原，CYFRA21-1 為細胞角蛋白19

CYFRA21-1（ng/ml）試驗組85 例 2463.55±522.49 25.83±8.81 1.01±0.45 101.03±16.82 3.82±3.57對照組85 名 209.75±117.05 10.44±3.92 0.93±0.39 2.57±0.49 1.85±0.95 t 38.810 14.710 1.240 53.950 4.979 P 0.000 0.000 0.217 0.000 0.000組別 人數(shù) KL-6（U/ml）NSE（ng/ml）SCC（ng/ml）CEA（ng/ml）

2.3.2 腫瘤標志物單項檢測與聯(lián)合檢測對肺癌患者的診斷效能比較

血 清KL-6、NSE、SCC、CEA、CYFRA21-1 腫瘤標志物單項檢測與聯(lián)合檢測對肺癌患者的診斷效能分析結果比較，ROC 曲線分析顯示，5 項腫瘤標志物聯(lián)合診斷肺癌的靈敏度為98.80%，特異度為97.60%，AUC為0.997，其靈敏度和AUC均分別高于5 項指標單一檢測，見表4 和圖2。KL-6、NSE、SCC、CEA、CYFRA21-1 5 項指標所形成的鑒別診斷體系診斷肺癌的AUC為0.997（95%CI：0.992～1.000，P＜0.01），最大約登指數(shù)為0.964，靈敏度為98.8%，特異度為97.6%，具有一定診斷價值。

圖2 5 項血清腫瘤標志物單項及其聯(lián)合檢測診斷肺癌的ROC 曲線

表4 腫瘤標志物單項檢測與聯(lián)合檢測對肺癌患者的診斷效能比較

3 討論

血清腫瘤標志物檢查在肺癌早期篩查中具有重要的參考預警價值，且能為其分期診斷提供重要參考價值。雖然單項血清腫瘤標志物檢查簡便、價格低，但診斷靈敏度和特異度欠佳。雖然多項腫瘤標志物聯(lián)合檢測價格相對較貴，但檢測效能優(yōu)于B 超、CT 或磁共振等影像學檢查，且診斷時間早，尤其對早期微灶腫瘤，多項腫瘤標志物聯(lián)合檢測能至少提前半年以上發(fā)現(xiàn)，為肺癌的臨床超早期診斷、治療爭取了寶貴的時間。近年來有研究表明，KL-6 血清學水平的高低與肺纖維化患者病情嚴重程度有較高的相關性，常作為肺纖維化病情評估、預后評價的生物學指標[12]，但其與肺癌的相關研究報道較少。本研究參考CLSI 指南標準建立KL-6 檢測精密度評價，確定KL-6 檢測的線性范圍和參考區(qū)間，結果顯示，KL-6 的LoB 為20 U/ml、最低檢出限LoD 為50 U/ml，該方法精密度良好，達到精密度質(zhì)量規(guī)范，在檢測范圍50～10 000 U/ml 內(nèi)成線性。該方法的精密性、檢測能力及線性范圍等均較為準確，符合臨床診斷需求，可以作為臨床診斷指標。

為了進一步探討KL-6 在肺癌診斷中的價值，本研究對KL-6 單一檢測和與其他指標聯(lián)合檢測進行價值分析，發(fā)現(xiàn)KL-6 單一指標檢測肺癌的靈敏度為80%，特異度為76.5%，AUC為0.838，其靈敏度、特異度和AUC均高于其他3 項指標NSE、SCC、CYFRA21-1， 說 明KL-6 對 肺 癌 臨床輔助診斷價值較高。 血清KL-6、NSE、SCC、CEA、CYFRA21-1 腫瘤標志物聯(lián)合檢測對肺癌患者的診斷效能分析結果顯示，聯(lián)合檢測AUC為0.997（95%CI：0.992～1.000，P＜0.01），最 大 約登指數(shù)0.964，靈敏度為98.8%，特異度為97.6%，具有極高診斷價值。

綜上所述，基于磁微粒全自動化學發(fā)光免疫技術建立的血清KL-6 檢測方法，符合CLSI 的EP5標準指南文件制定的相關性能指標參數(shù)，可作為臨床實驗室KL-6 的檢測方法與試劑。KL-6 單一診斷肺癌的價值雖較高，但聯(lián)合檢測血清KL-6、NSE、SCC、CEA、CYFRA21-1 的診斷靈敏度為98.8%，特異度為97.6%，對于明確診斷肺癌具有較高的臨床應用價值。