骨形態發生蛋白10 及其突變體在CHO 細胞中的表達

段 珂， 段作營， 金 堅

（1. 江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學生命科學與健康工程學院，江蘇 無錫 214122）

骨形態發生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）家族屬于TGF-β 超家族，是一類調節細胞生長和分化的細胞外信號多肽，可誘導骨髓充質干細胞成骨分化[1]。 骨形態發生蛋白10 是BMPs 家族中的一員，其表達被限制在心肌細胞中，在胚胎心臟發育和心肌修復過程中發揮重要作用[2]，在臨床上具有治療心力衰竭和降低腫瘤治療藥物造成的心臟毒性的潛力[3-4]。

天然BMP10 分子由424 個氨基酸殘基組成，全長單體蛋白質由信號肽（signal peptide）、前導肽（propeptide）和成熟肽（mature chain）3 部分組成[5]。1~21 位氨基酸為信號肽，22~316 位氨基酸為前導肽，317~424 位氨基酸為成熟肽，在前導肽與成熟肽連接處313~316 位氨基酸處有一個Furin 特異性識別位點RIRR↓316，在67 位和131 位氨基酸處存在兩個蛋白質糖基化位點[6]。

作者所在研究團隊前期在CHO 細胞中隨機整合并成功表達BMP10， 發現BMP10 前體蛋白proBMP10 （含前導肽和成熟肽） 而不是成熟肽rhBMP10 可能在藥物應用方面更有優勢[7]。 但由于Furin 的存在，造成表達產物不均一，給后續成藥造成一定困難。 據文獻報道，在Furin 的特異性識別位點（313~316 位氨基酸，RIRR↓316） 中，313 位與316位的精氨酸是發生切割的必要氨基酸[8]。 為了得到不被Furin 切割的單一形態的proBMP10，并在盡可能不改變蛋白質性質的情況下，考慮用同為堿性氨基酸的賴氨酸在這兩個位點對proBMP10 進行突變，突變體1（proBMP10-1）將313 位的精氨酸突變為賴氨酸（R313K），突變體2（proBMP10-2）將316位的精氨酸突變為賴氨酸（R316K）。

由傳統的隨機整合方法所得到的重組CHO 細胞，由于基因組的固有不穩定性、整合位點的不穩定性及細胞凋亡等因素的影響會造成外源蛋白質表達的不穩定性[9-10]。因此，本研究中采用作者所在研究團隊構建的抗凋亡IE3 細胞株（CHO-K1-BAK-/BAX-雙敲除細胞）， 并采用CRISPR/Cas9 技術[11-12]，在作者所在研究團隊篩選并已驗證可穩定表達外源蛋白質的特定位點[13]，定點整合proBMP10及其突變體proBMP10-1 和proBMP10-2 的基因，以期得到表達產物單一、 表達穩定、 有活性的proBMP10。

1 材料與方法

1.1 質粒與細胞

大腸桿菌DH5α 感受態細胞、EGFP 質粒、IE3細胞株（CHO-K1-BAK-/BAX-雙敲除細胞）由作者所在研究團隊構建并保存；pUC57/proBMP10、pUC57/proBMP10-1、pUC57/proBMP10-2 由南京金斯瑞公司合成；Psk-U6-gRNA 和Cas9-DTU 質粒由復旦大學盧大儒教授惠贈；proBMP10 活性測定細胞P19 由中國醫學科學院阜外醫院心血管疾病國家重點實驗室惠贈。

1.2 主要試劑

限制性內切酶（KpnⅠ、SmaI）和T4 DNA 連接酶： 賽默飛公司；DMEM-F12 培養基和胎牛血清（FBS）：美國Gibco 公司；質粒小量提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒： 上海生工生物工程有限公司；引物合成和測序由金唯智公司完成；anti-BMP10 propeptide 抗體、rhBMP10 標準品：R&D 公司； 其余試劑為國產或進口分析純產品。

1.3 proBMP10 及其突變體重組IE3 細胞株的構建

1.3.1 設計思路重組IE3 細胞株采用定點整合的方法進行構建， 整合位點是CHO 細胞基因組中NW_003626341.1 內第1 689 堿基（上下游1 614~1 763 堿基內）處[13]。 位于同源臂內的EGFP 和Puro為正選標記，mCherry 為反選標記，發生定點整合的細胞株在含嘌呤霉素的壓篩培養基中表現為只發綠光[13]。 供體片段定點整合方法如圖1 所示。

圖1 供體片段定點整合方法示意圖Fig. 1 Illustration of donor fragment site-specific integration

1.3.2 引物設計及合成proBMP10 及其突變體PCR 引物序列見表1。 其中：FL-5′和FL-3′的下劃波浪線部分為KpnⅠ和SmaⅠ的酶切位點；MID-5′和MID-3′為his-tag 和腸激酶識別位點引物， 下劃線部分為his-tag 和腸激酶堿基序列。5′arm-F 和5′arm-R 用來驗證5′arm 的定點整合，3′arm-F 和3′arm-R 引物用來驗證3′arm 的定點整合。 引物均由金唯智公司合成。

表1 proBMP10 及其突變體PCR 引物Table 1 Primers for amplification of proBMP10 protein and its mutants by PCR

1.3.3 供體質粒的構建以pUC57/proBMP10、pUC57/proBMP10-1、pUC57/proBMP10-2 質粒為模板， 分別以FL-5′和MID-3′、FL-3′和MID-5′為引物，進行PCR 擴增[14]。 割膠回收后再以回收液為模板，FL-3′和FL-5′為引物，再次進行PCR 擴增[14]。回收液和EGFP 質粒分別用KpnⅠ和SmaⅠ進行酶切，割膠回收后加入T4 DNA 連接酶進行連接，然后轉化至感受態E.coliDH5α，涂布于含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB 固體培養平板上，37 ℃過夜培養，第2 天挑取單菌落，進行菌落PCR 鑒定，并送金唯智公司進行測序。

1.3.4 細胞轉染將上述得到的3 個供體質粒分別與Psk-U6-gRNA 質粒及Cas9-DTU 質粒共轉染IE3 細胞株 （供體質粒、Psk-U6-gRNA 質粒、Cas9-DTU 質粒的質量比為1.8∶1.8∶1.0）[13]。 轉染之后的10 d 內，壓篩擴培抗藥細胞。

1.4 細胞克隆的篩選

待細胞池中細胞長到合適狀態時，用流式細胞儀挑選只發綠光不發紅光的單克隆細胞至96 孔板中， 用含體積分數10%胎牛血清的DMEM-F12 培養基培養10 d，擴培至24 孔板中，等到細胞匯合度達到80% 時更換無血清培養基培養48 h， 取上清液進行Dot blot 檢測。 選取表達目的蛋白質的陽性孔提取基因組， 分別以5′arm-F 和5′arm-R、3′arm-F和3′arm-R 為引物，進行PCR 定點整合驗證，并選取相對分子質量正確的條帶測序驗證[13]。 選取Dot blot 驗證和PCR 驗證都正確的單克隆，取上清液進行Western blot 檢測。 具體方法為：經120 g/L SDSPAGE 分離蛋白質，轉移至NC 膜上，以50 g/L 脫脂奶粉室溫封閉2 h；TBST 漂洗3 次， 加入anti-BMP10 propeptide 抗體（1∶1 000 稀釋），室溫孵育4 h；TBST 漂洗3 次，加入山羊抗小鼠二抗（1∶2 000稀釋），室溫孵育2 h；ECL 顯色成像[14]。

將篩選出的高表達克隆株擴培至6 孔板中，用含體積分數10%胎牛血清的DMEM-F12 培養基培養2 d 后，用PBS 清洗擴培至T25 培養瓶中，待到細胞匯合度達到90% 時擴培細胞至T75 培養瓶中，最后進行懸浮馴化，挑選表達量最高的細胞株，分別命名為IE3-proBMP10、IE3-proBMP10-1、IE3-proBMP10-2。

1.5 目的蛋白質的初步純化與Furin 酶切驗證

由于在構建proBMP10 及其突變體時， 在全長單體蛋白質的信號肽與前導肽之間， 即proBMP10分子的N 端，添加了his-tag 和腸激酶識別位點，因此，采用鎳柱對目的蛋白質進行初步純化。

高表達細胞株IE3-proBMP10、IE3-proBMP10-1、IE3-proBMP10-2 分別經3 L 搖瓶流加表達8 d，收集培養液。 經1 000g離心10 min 后保留上清液，上清液經8 000g離心40 min 后先經0.45 μm 濾膜再經0.22 μm 濾膜抽濾，過鎳柱純化。 以A 液（500 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、25 mmol/L 咪唑，pH 8.0）平衡柱子，收集流穿液；用上一步抽濾液上樣，最后直接以B 液（500 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、200 mmol/L 咪唑，pH 8.0）洗脫，收集洗脫峰處洗脫液， 經SDS-PAGE 和Western blot 檢測，取蛋白質液加入腸激酶，于37 ℃酶切12 h 后加入Furin 酶切1 h，進行Western blot 檢測。

1.6 目的蛋白質的活性檢測

BMP10 與受體結合后， 會使細胞內的Smad 6基因表達水平上升，因此采用qPCR 法檢測Smad 6表達情況作為proBMP10-2 活性的指標[15]。 采用不添加任何因子的培養基作為陰性對照，rhBMP10 標準品為陽性對照， 考慮到rhBMP10 和proBMP10-2分子大小的差異 （后者相對分子質量5.8×104約為前者1.3×104的4.5 倍）， 為保證反應體系中具有比較一致的物質的量濃度， 在測定時，rhBMP10 的質量濃度為100 μg/L，proBMP10-2 質量濃度為450 μg/L。

2 結果與分析

2.1 重組表達質粒的鑒定

在含100 μg/mL 氨芐青霉素的3 個LB 固體培養平板上各隨機挑選10 個克隆，經菌落PCR 鑒定，EGFP -proBMP10 的7、8、10 號克隆，EGFP -proBMP10-1 的8、9、10 號克隆，EGFP-proBMP10-2的11、13、14、 15 號克隆在約1 300 bp 處可見陽性條帶（見圖2）。

圖2 EGFP-proBMP10 及其突變體的菌落PCR 產物電泳圖Fig. 2 Electrophoresis diagram of EGFP-proBMP10 and its mutant colony PCR

分別從EGFP-proBMP10 的7 號克隆、EGFPproBMP10-1 的9 號克隆、EGFP-proBMP10-2 的11號克隆提取質粒， 并進行酶切鑒定， 在約1 300 bp處均可見特異性條帶（見圖3）。 對這3 個質粒進一步測序驗證， 結果與設計的基因序列比對結果一致，表明3 種重組表達質粒構建成功。

圖3 質粒EGFP-proBMP10 及其突變體酶切鑒定電泳圖Fig. 3 Electrophoresis diagram of plasmid EGFP -proBMP10 and its mutants by restriction digestion

2.2 細胞克隆的篩選

根據敲入整合策略，收集轉染后的細胞用流式細胞儀分選只發綠光的細胞， 培養10 d 后轉移至24 孔板， 取不含血清的細胞培養上清液經Dot blot篩選出proBMP10 及其突變體的表達株， 提取單克隆細胞基因組進行PCR 驗證，結果如圖4 所示。 結果顯示，proBMP10 的1 號和3 號克隆、proBMP10-1的4 號和5 號克隆以及proBMP10-2 的10 號克隆的5′端PCR 產物和3′端PCR 產物都同時出現了大小符合預期 （5′端約2 800 bp；3′端約3 200 bp）的DNA 條帶。通常當5′端和3′端引物同時擴增出大小符合預期的片段，就基本可以認為目的基因定點整合成功。對這5 株單克隆細胞株PCR 驗證產物進行測序， 結果表明在NW_003626341.1 內第1 689 堿基處成功敲入了含proBMP10 及其突變體編碼基因的DNA 片段，得到了定點整合的表達proBMP10 及其突變體的重組CHO-K1-IE3 工程細胞株。

圖4 proBMP10 及其突變體基因定點整合驗證結果Fig. 4 Verification of site-specific integration of proBMP10 and its mutant genes

取這5 株重組細胞克隆株的無血清貼壁培養上清液進行Western blot 分析， 在相對分子質量約5.8×104處均可見明顯條帶（見圖5），表明定點敲入的proBMP10 及其突變體基因成功表達。 目的蛋白質相對分子質量理論值為4.8×104，但電泳條帶顯示位置在相對分子質量5.8×104， 這與天然合成的proBMP10 電泳時呈現的分子大小是一致的[8]。 由于proBMP10 在67 位和131 位氨基酸處存在兩個蛋白質糖基化位點， 推測它們在CHO 細胞中表達時可能發生了糖基化。 此外，從圖5 中可以看出，在貼壁培養條件下， 無論proBMP10 還是其突變體，在Western blot 鑒定時都只在相對分子質量5.8×104處存在單一條帶，未觀察到Furin 酶切所形成的條帶。

圖5 重組CHO 單克隆細胞株貼壁培養上清液的Western blot 鑒定Fig. 5 Western blot identification of adherent culture supernatant of recombined CHO cells

2.3 proBMP10 及其突變體的初步純化及Furin酶切鑒定

經過懸浮馴化篩選出3 株高表達細胞株，分別命名為IE3-proBMP10、IE3-proBMP10-1、IE3-proBMP10-2。 在CD 培養基中流加表達8 d，取發酵上清液進行鎳柱純化，將發酵上清液、流穿液、洗脫液分別進行SDS-PAGE 分析，結果見圖6。 結果顯示，3 株細胞株的發酵上清液過鎳柱后基本實現了純化。IE3-proBMP10 和IE3-proBMP10-1 的鎳柱洗脫液除了在相對分子質量5.8×104處出現了明顯條帶之外， 在相對分子質量4.5×104處也出現了可見條帶，而IE3-proBMP10-2 只在相對分子質量5.8×104處有可見條帶。

圖6 重組細胞流加培養液鎳柱純化的SDS-PAGE 分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis of recombinant cells with added culture medium purified by nickel column chromatography

對上述電泳結果同時進行Western blot 鑒定，結果如圖7 所示。 可以看出，IE3-proBMP10、IE3-proBMP10-1 目的蛋白質鎳柱純化產物分別在相對分子質量5.8×104和4.5×104處可見2 個條帶，而IE3-proBMP10-2 目的蛋白質鎳柱純化產物在相對分子質量5.8×104可見單一條帶。 表明IE3-proBMP10 和IE3-proBMP10-1 所表達的目的蛋白質有可能被Furin 酶切，而IE3-proBMP10-2 突變株表達的目的蛋白質則可能不再被Furin 酶切。

圖7 目的蛋白質鎳柱純化產物的Western blot 分析Fig. 7 Western blot analysis of purified target proteins by nickel column

為了進一步驗證， 進行了Furin 體外酶切實驗， 結果如圖8 所示。 Furin 酶切后，anti-BMP10 propeptide 抗體的雜交結果顯示，proBMP10 和proBMP10-1 在相對分子質量5.8×104的條帶基本消失， 而在相對分子質量4.5×104處的條帶得到了加強。 表明proBMP10-1 的確和proBMP10 一樣，仍可以被Furin 酶切，proBMP10 分子上313 位的精氨酸不是Furin 酶切必需的， 將其替代為賴氨酸并不能阻止切割的發生。 而proBMP10-2 仍在相對分子質量5.8×104處出現單一條帶， 未在相對分子質量4.5×104處出現Furin 切割典型條帶， 表明proBMP10-2 突變體不再被Furin 識別和切割，proBMP10 分子上316 位的精氨酸是Furin 酶切必需的。

圖8 目的蛋白質酶切后的Western blot 分析Fig. 8 Western blot analysis of target proteins after digestion

2.4 目的蛋白質的活性

為了驗證不能被Furin 酶切的proBMP10-2 突變體是否仍具有生物活性，采用qPCR 檢測Smad 6相對表達量，結果如圖9 所示。結果表明，proBMP10-2經腸激酶酶切前后， 都具有一定的活性，Smad 6表達量分別為陰性對照的6.3 倍和6.2 倍， 與相同濃度下的rhBMP10 標準品活性相當。 表明proBMP10-2具有生物活性，且his-tag-DDDDK 標簽的存在對其活性無明顯影響。

圖9 proBMP10-2 的活性檢測Fig. 9 Determination of activity of proBMP10-2

3 結 語

本研究中構建了proBMP10 Furin 酶切位點的突變體proBMP10-1（R313K）和proBMP10-2（R316K）。 實驗結果表明，將proBMP10 分子中313位精氨酸突變為賴氨酸并不能阻止Furin 對proBMP10 的酶切，而將proBMP10 分子中316 位精氨酸突變為賴氨酸則可以阻止Furin 對proBMP10的酶切。 活性測定結果表明，改造后的proBMP10-2仍具有生物活性， 這有效避免了proBMP10 表達產物不均一的問題，為其成藥提供了一條新思路。

應用作者所在研究團隊建立的CHO 定點整合表達體系，在抗凋亡的IE3 細胞株（CHO-K1-BAK-/BAX-雙敲除細胞）中，篩選得到了目的蛋白質的穩定表達細胞株IE3-BMP10、IE3-BMP10-1 和IE3-BMP10-2，縮短了重組細胞株的構建流程，驗證了作者所在研究團隊建立的定點整合體系的有效性。