蜂蜜中轉(zhuǎn)基因成分啟動(dòng)子和終止子的多重實(shí)時(shí)熒光PCR 法檢測(cè)

林碧蓮， 張雅薇， 高 宇， 何孟杭， 邱秀玉， 韓 濤，張 芳， 傅德江， 陳思琪， 宋 帆， 柯振華

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢測(cè)中心(福州), 福建 福州 350002）

轉(zhuǎn)基因作物具有產(chǎn)量大[1]、利潤(rùn)多[2-3]、抵抗力強(qiáng)[4-7]及其他特性[8]等優(yōu)勢(shì)，在全球種植面積不斷擴(kuò)大[9]。 對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物的安全性，一直存在激烈爭(zhēng)議，目前還未有足夠證據(jù)可以證明它對(duì)人體和環(huán)境無(wú)副作用，科技界也未有定論。 人們對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的發(fā)展不斷提出安全問(wèn)題， 如基因編輯過(guò)程中，由于無(wú)意的基因轉(zhuǎn)移和環(huán)境釋放，可能給環(huán)境和人類(lèi)帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)和不確定性[10-16]。 科學(xué)家也發(fā)現(xiàn)隨著基因的流動(dòng)，轉(zhuǎn)基因作物基因流向非轉(zhuǎn)基因作物[17-18]，并已逐漸滲透到食物中，如蜂蜜[19-21]。

我國(guó)是全球最大的蜂蜜生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)，約占全球蜂蜜出口量的1/4， 大部分蜂蜜生產(chǎn)者是個(gè)體養(yǎng)蜂者，蜂蜜的蜜源植物沒(méi)有限定，隨著轉(zhuǎn)基因植物種類(lèi)、數(shù)量的不斷增加，蜜源植物中的轉(zhuǎn)基因植物比例相應(yīng)也會(huì)不斷增加，蜜蜂采到轉(zhuǎn)基因植物花粉的可能性也就越大。 我國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物一直采取的是謹(jǐn)慎的態(tài)度和嚴(yán)格的管理，為了規(guī)范轉(zhuǎn)基因作物對(duì)人們帶來(lái)的潛在危險(xiǎn)，國(guó)家相關(guān)部門(mén)出臺(tái)了政策規(guī)范，也制定一些標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。 但轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展迅猛，轉(zhuǎn)基因成分越來(lái)越多樣化，對(duì)應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)也需不斷提高。

至今，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株都含有pCaMV35S 和（或）tNOS。 但在一些新的轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)中，pCaMV35S和tNOS 完全缺失。 現(xiàn)已出現(xiàn)的其它啟動(dòng)子和終止子 還 有 pFMV35S、pNOS、pSSuAra、pTA29、pUbi、tCaMV35S、tE9、tOCS、tg7 等[22]，國(guó)家相關(guān)部門(mén)也出臺(tái)了檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選[23]，均為單重實(shí)時(shí)熒光PCR法。若采用單重實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)對(duì)蜂蜜開(kāi)展上述所有啟動(dòng)子和終止子的檢測(cè)，量大效率低，而多重實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)一管多檢， 可實(shí)現(xiàn)高效率的檢測(cè)，在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)中已得到了廣泛應(yīng)用[24-30]，但專(zhuān)門(mén)針對(duì)蜂蜜中啟動(dòng)子和終止子的多重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系未見(jiàn)報(bào)道。

目前轉(zhuǎn)基因作物中啟動(dòng)子和終止子主要以pCaMV35S 和tNOS 為主，含有至少兩者之一的作物所占比例為85%以上[29]，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，啟動(dòng)子pSSuAra 和pTA29 一般同時(shí)出現(xiàn)， 只需測(cè)試其中一種[22]。 基于此，本研究中先建立pCaMV35S 和tNOS的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系，剩余8 種啟動(dòng)子和終止子建立兩組四重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系，雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 進(jìn)行初步篩選，未檢出的樣品再采用另外兩組四重實(shí)時(shí)熒光PCR 進(jìn)行檢測(cè)。 由10 次的檢測(cè)變成3 次檢測(cè)，降低檢測(cè)成本、擴(kuò)大檢測(cè)范圍、提高工作效率，為蜂蜜中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)提供一種更為高效的檢測(cè)技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品及試劑40 份蜂蜜樣品：市售；GoTaq qPCR Master MIX 預(yù)混液：普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；高效植物基因組DNA 提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)所用轉(zhuǎn)基因質(zhì)控品轉(zhuǎn)基因油菜GT73/RT73 種子粉末（GT73/RT73）、轉(zhuǎn)基因油菜Ms1 葉子組織的基因組DNA（Ms1）、轉(zhuǎn)基因玉米MON88017種子粉末（MON88017）、馬鈴薯轉(zhuǎn)基因成分（EH92-527-1）：AOCS （美國(guó)石油化學(xué)家學(xué)會(huì)）； 轉(zhuǎn)基因棉籽、轉(zhuǎn)基因大豆種子粉末（GTS-40-3-2）：歐盟委員會(huì)聯(lián)合研究中心； 轉(zhuǎn)基因玉米種子粉末（QC-GM-008）、 轉(zhuǎn)基因玉米 MON89034 種子粉末（MON89034）、 轉(zhuǎn)基因玉米Bt11 品系種子粉末（Bt11） 、非轉(zhuǎn)基因大豆種子粉末（QC-GM-001）、轉(zhuǎn)基因大豆89788 種子粉末（89788）、轉(zhuǎn)基因大米種子粉末（QC-GM-018） ：中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心；轉(zhuǎn)基因玉米酒糟粕U862（U862）、非轉(zhuǎn)基因玉米酒糟粕J331（J331）：作者所在實(shí)驗(yàn)室收集。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI 7500 熒光PCR 儀： 美國(guó)Life Tech 公司；Mini spin 小型離心機(jī)： 德國(guó)Eppendorf 公司；IKA MS3 basic 渦旋混合器： 上海琪特分析儀器有限公司；CR22GⅢ落地式冷凍離心機(jī)：日本Hitachi KoKi公司；Ultrospec 2100pro 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)GE 公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂蜜樣品和轉(zhuǎn)基因質(zhì)控品DNA 的提取蜂蜜樣品于50 ℃水浴20 min 至充分融化， 上下顛倒混勻。取20 g 的蜂蜜至50 mL 的離心管中，各2 管，加40 ℃的純化水30 mL，振蕩混勻溶解，4 500 r/min離心10 min， 去上清液， 加1 mL 的純化水溶解沉淀，吸出至2 mL 離心管中，4 500 r/min 離心10 min，再用純化水清洗后4 500 r/min 離心10 min，去上清液，所得沉淀根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA。 轉(zhuǎn)基因質(zhì)控品根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA 提取。

1.3.2 引物、探針的篩選及配對(duì)測(cè)試通過(guò)查閱文獻(xiàn)及參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，以pCaMV35S、tNOS、pFMV35S、pNOS、pUbi、pTA29、tE9、tOCS、tg7、tCaMV35S 為研究靶標(biāo)，采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19495.4—2018[23]中的引物、探針序列，選擇吸光度差異比較大的JOE、ROX、FAM、CY5 作為多種探針的發(fā)光基團(tuán)，10 種引物、探針?lè)殖? 組，pCaMV35S 和tNOS 為一組，pFMV35S、pNOS、pUbi、pTA29、tE9、tOCS、tg7、tCaMV35S 的引物和探針進(jìn)行組合測(cè)試，確定兩組四重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)引物和探針的最佳組合，采用真核生物內(nèi)參基因18S rRNA 驗(yàn)證是否提取到試樣DNA，所用引物、探針的序列及最佳組合見(jiàn)表1，引物、 探針均委托上海生工生物工程有限公司合成。

表1 3 組多重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系引物、探針序列Table 1 Three groups of multiple real-time fluorescent PCR systems primers and probes sequence

1.3.3 多重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化根據(jù)前期篩選測(cè)試情況，對(duì)3 組多重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化 （見(jiàn)表2）。 反應(yīng)體系總體積25 μL，GoTaq qPCR Master MIX 預(yù)混液12.5 μL，模板DNA 2 μL，引物對(duì)（10 μmol/L）和探針（10 μmol/L）根據(jù)表2 中的加量進(jìn)行測(cè)試，水補(bǔ)足至25 μL。多重實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，共進(jìn)行45 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號(hào)。 先優(yōu)化引物、探針體積，再進(jìn)行退火溫度的測(cè)試，測(cè)試溫度為58、60、62 ℃。

表2 3 組多重實(shí)時(shí)熒光PCR 體系引物探針的優(yōu)化Table 2 Optimization of primers /probes for three groups of multiple real-time fluorescent PCR systems

1.3.4 多重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系靈敏度的測(cè)試以質(zhì)量濃度為100 ng/μL 的QC-GM-008 DNA 為原液，用純化水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)@得質(zhì)量濃度分別為100、 10、1.0、0.1、0.01、0.001 ng/μL 的靈敏度測(cè)試樣品，進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增，每個(gè)樣品4 個(gè)平行， 以確定雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系的靈敏度。因找不到同時(shí)含有10 種目的基因的陽(yáng)性對(duì)照樣，本研究中以轉(zhuǎn)基因油菜Ms1 葉子組織的基因組DNA、 轉(zhuǎn)基因油菜GT73/RT73 種子粉末提取的DNA 和轉(zhuǎn)基因棉籽提取的DNA， 分別稀釋到120 ng/μL 后，各取相同量混勻，再用純化水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?獲得質(zhì)量濃度分別為40、4.0、0.4、0.04、0.004 ng/μL 的靈敏度測(cè)試樣品， 進(jìn)行四重實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品4 個(gè)平行，以確定兩組四重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系的靈敏度。

1.3.5 多重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系質(zhì)控品測(cè)試比對(duì)選取國(guó)內(nèi)外權(quán)威機(jī)構(gòu)的12 份轉(zhuǎn)基因質(zhì)控品和2 份作者所在實(shí)驗(yàn)室自備的轉(zhuǎn)基因樣品，提取其基因組DNA 為模板， 分別進(jìn)行單重實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增和多重實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增，驗(yàn)證這3 組多重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系的準(zhǔn)確性。

1.3.6 40 份市售蜂蜜樣品轉(zhuǎn)基因啟動(dòng)子和終止子的多重實(shí)時(shí)熒光PCR 法檢測(cè)提取40 份市售蜂蜜樣品的DNA，進(jìn)行真核生物內(nèi)參基因18S rRNA 的檢測(cè)，確認(rèn)提取到DNA 后，進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光PCR初步篩選，陰性樣品采用A 組四重實(shí)時(shí)熒光PCR 進(jìn)行檢測(cè)，再次陰性樣品采用B 組四重實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化

為實(shí)現(xiàn)快速篩選蜂蜜中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，選用10 種啟動(dòng)子和終止子進(jìn)行多重實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。 為實(shí)現(xiàn)同一管中檢測(cè)多對(duì)目的基因，調(diào)整反應(yīng)條件和反應(yīng)程序，最終結(jié)果為：3 組多重實(shí)時(shí)熒光PCR 的退火溫度均為60 ℃， 反應(yīng)體系總體積25 μL，其中GoTaq qPCR Master MIX 預(yù)混液12.5 μL、模板DNA 2 μL。 雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 引物和探針的添加體積最優(yōu)組為第3 種組合： 發(fā)光基團(tuán)為FAM的上下游引物各為0.5 μL、探針為0.25 μL，發(fā)光基團(tuán)為JOE 的上下游引物各為1 μL、探針為1 μL，共4.25 μL；加水6.25 μL。 兩組四重實(shí)時(shí)熒光PCR 引物和探針的添加體積最優(yōu)組為第4 種組合：發(fā)光基團(tuán)為FAM 的上下游引物各為1 μL、探針為0.5 μL，發(fā)光基團(tuán)為JOE 和CY5 的上下游引物各為1 μL、探針為1 μL， 發(fā)光基團(tuán)為ROX 的上下游引物各為0.5 μL、探針為0.25 μL，共9.75 μL；加水0.75 μL。3 組多重實(shí)時(shí)熒光PCR 的10 種靶基因均能擴(kuò)增，CK 為空白試劑，擴(kuò)增曲線如圖1~3 所示，曲線無(wú)重疊，辨識(shí)度高，熒光強(qiáng)度到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（CT 值）差異最小，CT 值均小于28，符合國(guó)內(nèi)轉(zhuǎn)基因國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[23]和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[31-32]陽(yáng)性對(duì)照的要求。

圖1 雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增曲線Fig. 1 Amplification curves of dual real-time fluorescence PCR

圖2 A 組四重實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增曲線Fig. 2 Amplification curves of group A with quadruple real-time fluorescence PCR

圖3 B 組四重實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增曲線Fig. 3 Amplification curves of group B with quadruple real-time fluorescence PCR

2.2 3 組多重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系靈敏度的測(cè)試

將含目的基因的陽(yáng)性樣品進(jìn)行一系列稀釋?zhuān)M(jìn)行3 組多重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系靈敏度的測(cè)試，結(jié)果為：雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 在DNA 質(zhì)量濃度為100、10、1.0、0.1、0.01 ng/μL 時(shí)， 兩條曲線均擴(kuò)增正常；A 組四重實(shí)時(shí)熒光PCR 在DNA 質(zhì)量濃度為40、4.0、0.4、0.04 ng/μL 時(shí)，4 條曲線擴(kuò)增正常，當(dāng)陽(yáng)性樣品DNA 質(zhì)量濃度為0.004 ng/μL時(shí)只有pFMV35S 和pUbi 有擴(kuò)增；B 組四重實(shí)時(shí)熒光PCR 在DNA 質(zhì)量濃度為40、4.0、0.4、0.04 ng/μL 時(shí)，4 條曲線擴(kuò)增正常， 當(dāng)陽(yáng)性樣品DNA質(zhì)量濃度為0.004 ng/μL 時(shí)只有tCaMV35S 有擴(kuò)增， 所以3 組多重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系的靈敏度分別是0.01、0.04、0.04 ng/μL， 擴(kuò)增CT 值見(jiàn)表3 和表4。

表3 雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系的靈敏度Table 3 Sensitivity of dual real-time fluorescence PCR system

表4 兩組四重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系的靈敏度Table 4 Sensitivity of two groups of quadruple real-time fluorescence PCR systems

2.3 3 組多重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系質(zhì)控品測(cè)試比對(duì)

對(duì)14 份轉(zhuǎn)基因質(zhì)控品進(jìn)行單重和多重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)比較分析，結(jié)果表明兩種方法檢測(cè)的結(jié)果一致 （見(jiàn)表5）。 12 份轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性質(zhì)控品中檢出pCaMV35S 有9 份，檢出tNOS 有9 份，檢出pFMV35S有4 份，檢出pTA29 有1 份，檢出tOCS 有1 份，檢出pUbi 有6 份， 檢出tCaMV35S 有3 份， 檢出tg7有1 份，檢出tE9 有2 份，檢出pNOS 有2 份，含單一啟動(dòng)子和 （或） 終止子的質(zhì)控品有1 份， 不含pCaMV35S 和tNOS 的質(zhì)控品有2 份。陰性質(zhì)控品均未檢出啟動(dòng)子和終止子。

表5 多重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系適用性驗(yàn)證結(jié)果Table 5 Applicability verification results of multiple real-time fluorescence PCR reaction systems

2.4 40份市售蜂蜜樣品轉(zhuǎn)基因啟動(dòng)子和終止子的檢測(cè)結(jié)果

40 份市售蜂蜜樣品提取的DNA 經(jīng)18S rRNA內(nèi)參基因檢測(cè)均為陽(yáng)性，經(jīng)3 組啟動(dòng)子和終止子的多重實(shí)時(shí)熒光PCR 法檢測(cè)， 有兩份樣品檢出pCaMV35S 和tNOS，其余未檢出。 至今我國(guó)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因作物只有抗蟲(chóng)棉和抗病番木瓜，蜂農(nóng)養(yǎng)的蜜蜂受到指引，采到這些植物的可能性低，而本文中測(cè)試的蜂蜜樣品為市面上流通產(chǎn)品，不是專(zhuān)門(mén)的抗蟲(chóng)棉和抗病番木瓜蜂蜜，陽(yáng)性樣品檢出率低屬正常現(xiàn)象。

3 結(jié) 語(yǔ)

啟動(dòng)子是位于基因5′端上游的DNA 序列，能活化RNA 聚合酶，使之與模板DNA 準(zhǔn)確的結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性，沒(méi)有啟動(dòng)子的目的基因就無(wú)法在細(xì)胞中啟動(dòng)復(fù)制。 終止子是指終止RNA 轉(zhuǎn)錄的DNA 序列。 插入的外源基因在細(xì)胞中要正常表達(dá)均需要有啟動(dòng)子和（或）終止子。

多重實(shí)時(shí)熒光PCR 已是國(guó)內(nèi)常用檢測(cè)技術(shù)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)有多重實(shí)時(shí)熒光PCR 主要針對(duì)某種或某類(lèi)植物，檢測(cè)同一品系的轉(zhuǎn)基因成分或常見(jiàn)轉(zhuǎn)基因成分的組合， 比如董立明等建立的CaMV35S 啟動(dòng)子、NOS 終止子、Cry1Ab/Ac 基因、HPT 基因和SPS 水稻內(nèi)標(biāo)基因的組合， 用于檢測(cè)水稻轉(zhuǎn)基因成分[33]；邢珍娟等基于DAS40278-9、BLVA430101、pCaMV35S、tNOS、Cry1Ab/Ac 基因、pat 基因和內(nèi)源基因zSSIIb 建立的五重實(shí)時(shí)熒光PCR 和雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)玉米轉(zhuǎn)基因成分[34]；邵彪等基于pCaMV35S、tNOS 和NPTII 基因建立的多重實(shí)時(shí)熒光PCR，用于檢測(cè)肉制品轉(zhuǎn)基因成分[35]。而蜂蜜中的蜜源植物多樣，難以定位到它可能含有的某種轉(zhuǎn)基因植物花粉，篩選難度大，該研究以啟動(dòng)子和終止子為研究對(duì)象，建立多重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行初篩，實(shí)現(xiàn)大范圍快速檢測(cè)，以精準(zhǔn)定位轉(zhuǎn)基因可疑陽(yáng)性樣品，提高檢測(cè)效率。

本研究中建立的3 組多重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系， 能準(zhǔn)確地檢測(cè)14 份轉(zhuǎn)基因質(zhì)控品的啟動(dòng)子和終止子，具有很好的適用性，靈敏度分別為0.01、0.04、0.04 ng/μL，可對(duì)大批量、未知轉(zhuǎn)基因成分的蜂蜜進(jìn)行檢測(cè)。 這種高效的檢測(cè)手段，可為我國(guó)蜂蜜中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)提供一定的技術(shù)支撐，同時(shí)也適用于其它產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)。