對蝦產品疫病雙重熒光RPA 方法的建立和初步應用

張 娜， 謝艷輝， 仇保封， 鄭舒尹， 斯澤恩， 李家僑*

（1. 湛江海關技術中心，廣東 湛江 524000；2. 南通海關技術中心，江蘇 南通 226004）

隨著南美白對蝦養殖規模不斷擴大，對蝦疫病的發生成為了對蝦養殖業發展的瓶頸之一，為保護我國水產養殖業的健康發展，我國對進出口冷凍水產品的疫病監測項目逐漸增多，對出口貿易國家的水產品養殖的疫病評估更加嚴格。

傳染性皮下及造血器官壞死病毒是引起對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病（infectious hypodermal and hematopoietic necrosis，IHHN） 的病源[1]。 IHHNV 能夠對其造成高的致病率和死亡率（90%）， 可以使斑節對蝦以及凡納濱對蝦等出現矮小殘缺綜合征（runt-deformity syndrome，RDS），感染該病毒的對蝦長不大，導致養殖產量大受影響，養殖過程中進行有效的生物安保措施是預防該病的最有效的方法[2]，而該病無有效的治療方法。

蝦肝腸胞蟲是近幾年新發現的寄生于對蝦肝胰腺組織的新病原，盡管蝦肝腸胞蟲不會像對蝦白斑病、黃頭病、急性肝胰腺壞死病等急性傳染病那樣引起對蝦大量死亡，但會導致蝦生長緩慢，參差不齊，養殖效率急劇下降，給對蝦養殖業帶來了巨大損失[3-5]。

隨著分子生物學技術的發展，目前出現了多種等溫核酸擴增技術，如鏈置換擴增法（SDA）、轉錄介導擴增法（TMA）、解旋酶恒溫基因擴增法（HAD）、環介導等溫擴增法（LAMP）、重組酶聚合酶擴增法和重組酶介導擴增法（RAA）[6]。

重組酶聚合酶擴增是高威芳等研究出的一種新型等溫DNA 擴增方法[7]，RPA 需要DNA 聚合酶、T4 重組酶、 單鏈DNA 結合蛋白 （SSB） 以及輔助DNA 聚合酶的蛋白質。 在模板DNA 鏈上匹配到互補鏈，并啟動DNA 合成；不進行核酸解鏈和退火，在37 ℃即可進行核酸擴增； 在擴增體系中加入一個EXO 探針， 可以在擴增過程中實時監測熒光信號，通過收集熒光即可實現檢測的實時監控。 該方法優點在于靈敏、 快速， 在20~30 min 即可完成檢測，不需要復雜的機器進行熱循環[8-9]。 RPA 技術已經被應用到多種動物病原的檢測上，如鰻利斯頓氏菌[10]、寄生蟲[11]、牛冠狀病毒[12]、犬細小病毒[13]、流感病毒[14]等。

目前RPA 技術在蝦類病原體檢測方面的報道還比較少，為了方便病原監測，希望在重組酶聚合酶等溫擴增核酸的基礎上，開發出多重熒光RPA 方法。 本研究中應用實時熒光RPA 檢測技術，根據蝦肝腸胞蟲（EHP）和傳染性皮下及造血器官壞死病毒（IHHNV）的保守序列設計引物、探針，實現對以上兩種病原體的簡便、快速、高效、高通量檢測。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備

centrifuge 5417R 高速冷凍離心機：Eppendorf公司；7500 熒光PCR 儀：ABI 公司；Q5000 核酸濃度分析儀：Qua Well 公司。

1.2 主要試劑

RPA 熒光檢測試劑盒 （Twist Amp DNA Amplification Exo Kits）：TwistDx lnc 公司； DNeasy?Blood and Tissue Kit：Qiagen 公司；DNA 純化回收試劑盒、質粒DNA 抽提試劑：TAKARA 公司；PCR 管等：Axygen 公司。

1.3 陽性樣本

所使用的陽性樣本為作者所在實驗室保存的IHHNV 和EHP 陽性南美白對蝦組織樣本。

1.4 引物和探針設計合成

根據IHHNV 基因組序列（GenBank：JX258653），分析該病原體的特異性序列， 選擇IHHNV 中非結構蛋白2（non-structural protein 2，NS2）和蝦肝腸胞蟲的核糖體小亞基（small subunit ribosomal，SSR）基因序列（GenBank MT539781.1）的保守序列設計引物、探針，具體引物、探針見表1。 引物、探針合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

表1 雙重熒光RPA 檢測體系所用引物、探針序列Table 1 Primer and probe sequences for the duplex fluorescent RPA detection system

1.5 方法

1.5.1 組織樣本DNA 提取取作者所在實驗室保存的IHHNV 和EHP 陽性南美白對蝦組織樣本，放入1.5 mL 離心管中。 兩個樣本分別按照DNeasy?Blood and Tissue Kit 的說明提取DNA，存放于-20 ℃冰箱中待用。

1.5.2 陽性質粒構建取提取的IHHNV 和EHP的DNA，分別用設計的上下游引物進行PCR 擴增，擴增體系為：10×PCR buffer（Mg2+plus）2.5 μL，上下游引物各（10 μmol/L）1 μL，dNTP（10 μmol/L）2 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，提抽物5 μL，加水至25 μL。 擴增程序為：95 ℃3 min；95 ℃1 min，60 ℃1 min，72 ℃1 min，35 個循環；72 ℃10 mim，4 ℃保存。 擴增產物進行測序分析和比對。

將10 μL PCR 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，切下目的條帶，按照DNA 純化回收試劑盒說明書進行回收； 將回收的擴增片段與pMD18-T 載體連接并轉化和培養， 挑取單克隆進行質粒提取和PCR 鑒定后進行測序，測序結果與擴增基因的片段序列進行核苷酸序列同源性分析。 用核酸濃度分析儀測定提取的重組質粒的DNA 濃度。 將提取好的重組質粒作為本實驗標準品，-20 ℃保存。

1.5.3 IHHNV、EHP 的熒光RPA 方法的建立以IHHNV 的陽性質粒為模板， 建立熒光RPA 檢測體系， 反應體系為50 μL， 包括：Rehydration Buffer 25 μL，雙蒸水15.4 μL，上游引物和下游引物各2.0 μL，探針為0.6 μL，模板5 μL（分別為陽性質粒、陰性對照、空白對照、EHP 的DNA 模板）。

以EHP 陽性質粒為模板， 建立熒光RPA 檢測體系， 反應體系為50 μL， 包括：Rehydration Buffer 25 μL，雙蒸水15.4 μL，上游引物和下游引物各2.0μL，探針為0.6 μL，模板5 μL（分別為陽性質粒、陰性對照、空白對照、IHHNV 的DNA 模板）。

以上反應體系溶液混勻后進行瞬時離心，然后加入到含有凍干粉的0.2 mL 的Twist Amp Exo RPA 反應管中， 充分混勻。 最后加入醋酸鎂（280 mmol/L）2.5 μL，混勻后進行瞬時離心，分別將反應管放入檢測儀器內檢測。

擴增程序分別設置為：溫度37 ℃，共30 個循環， 每個循環1 min， 每1 min 檢測一次熒光信號；IHHNV 熒光信號檢測通道為VIC，EHP 熒光信號檢測通道為FAM。

1.5.4 雙重熒光RPA 擴增體系的優化雙重RPA熒光檢測反應體系為50 μL， 包括：Rehydration Buffer 25 μL， 模板DNA 5 μL （模板樣本分別為：IHHNV 和EHP 混合陽性質粒、 陰性對照、 空白對照），并對不同體積的引物、探針體系進行優化，所有組分加入后加水至50 μL。

第1 組：EHP-F、EHP-R 各1.5 μL，EHP-P 0.8 μL；IHHNV-F、IHHNV-R 各2.0 μL，IHHNV-P 0.6 μL。 第2 組：EHP-F、EHP-R 各2.0 μL，EHP-P 0.6 μL；IHHNV-F、IHHNV-R 各2.0 μL，IHHNV-P 0.6 μL。 第3 組：EHP-F、EHP-R 各2.0 μL，EHP-P 0.6 μL；IHHNV-F、IHHNV-R 各1.5 μL，IHHNV-P 0.8 μL。

每組體系中將以上加入的組分進行渦旋混勻，并在6 000 r/min 瞬時離心后加入到含有凍干粉的0.2 mL 的Twist Amp Exo RPA 反應管中， 充分混勻。 最后加入醋酸鎂（280 mmol/L）2.5 μL，混勻并瞬時離心后放入檢測儀器內檢測。

擴增程序選擇37 ℃，30 個循環，每個循環1 min，每個循環采集一次熒光信號；熒光信號檢測通道選擇FAM 和VIC。

1.5.5 雙重熒光RPA 方法的特異性驗證分別抽提IHHNV、EHP、 急性肝胰腺副溶血性弧菌（AHPND）、對蝦白斑綜合征病毒（WSSV）、蝦傳染性肌肉壞死病毒（IMNV）、蝦基因組、魚基因組的核酸樣本。 將上述7 種病原體樣本混合測試，以檢驗建立的反應體系對EHP 和IHHNV 的檢測特異性，以及對干擾核酸的抗干擾檢測能力。

1.5.6 雙重熒光RPA 方法的靈敏度驗證將建立好的IHHNV 陽性質粒和EHP 陽性質粒分別進行稀釋， 得到1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL共5 個濃度梯度。 每個濃度模板分別測試3 個重復，以測試建立方法的靈敏度。

1.5.7 雙重熒光RPA 方法的重復性驗證將建立好的IHHNV 陽性質粒和EHP 陽性質粒分別進行稀釋， 混合至濃度均為2×103copies/μL， 重復檢測10 個模板，來驗證方法的重復性。 分別計算各自的CT 值的變異系數（CV），計算公式為：

式中：CV為10 個檢測CT 值的變異系數，%；S為10個檢測CT 值的標準偏差；X為10 個檢測CT 值的算術平均值。

1.5.8 雙重熒光RPA 方法的實際樣本檢測及方法學對比進口冷凍帶頭對蝦樣本共20 份， 每份樣本30 只蝦， 無菌采集蝦鰓和肝胰腺等器官制備成一份混合樣本。 分別進行組織勻漿和離心并提取核酸。 每個樣本取5 μL 核酸分別用建立的雙重熒光RPA 方法檢測， 同時每個樣本用熒光PCR 方法進行平行對比。

2 結果與分析

2.1 IHHNV 和EHP 的熒光RPA 方法的建立

分別以陽性質粒、陰性對照、空白對照、EHP 或IHHNV 的DNA 作為模板， 建立IHHNV 和EHP 熒光RPA 檢測體系。 IHHNV 熒光RPA 方法擴增結果如圖1 所示， 可以看出只有IHHNV 陽性質粒擴增明顯，EHP 的DNA 模板、陰性對照、空白對照均沒有擴增；EHP 熒光RPA 方法擴增結果如圖2 所示，結果只有EHP 陽性質粒有明顯擴增，IHHNV 的DNA 模板、陰性對照、空白對照均沒有擴增。結果證明IHHNV、EHP 的熒光RPA 方法構建成功。

圖1 IHHNV 熒光RPA 方法擴增結果Fig. 1 Amplification results of IHHNV by fluorescent RPA method

2.2 雙重熒光RPA 方法擴增體系的優化

分別設置3 組不同體積的引物、探針體系，IHHNV選擇VIC 熒光信號檢測通道，EHP 選擇FAM 熒光信號檢測通道。3 組體系擴增結果如圖3~5 所示。由圖3 可以看出， 第1 組的擴增效果最好，IHHNV 和EHP 陽性質粒擴增曲線均勻性最好， 擴增效率最高；而第2 組的IHHNV 陽性質粒擴增效率差（見圖4）；第3 組的IHHNV 和EHP 的陽性質粒擴增效率最差（見圖5）。綜合比對，第1 組的體系擴增效果最優， 即EHP-F、EHP-R 各1.5 μL，EHP-P 0.8 μL；IHHNV-F、IHHNV-R 各2.0 μL，IHHNV-P 0.6 μL。

圖3 第1 組引物、探針體系擴增結果Fig. 3 Amplification results of the first set of primer and probe system

圖4 第2 組引物、探針體系擴增結果Fig. 4 Amplification results of the second set of primer and probe system

圖5 第3 組引物、探針體系擴增結果Fig. 5 Amplification results of the third set of primer and probe system

2.3 雙重熒光RPA 方法特異性驗證結果

使用IHHNV、EHP、AHPND、WSSV、IMNV、 蝦基因組、魚基因組的核酸，將上述7 種病原體核酸混合測試，檢驗所建立的雙重熒光RPA 方法的特異性。 結果如圖6 所示，IHHNV 和EHP 的DNA 樣本檢測結果擴增曲線明顯，其余5 種核酸樣本都未見明顯的擴增曲線。

圖6 雙重熒光RPA 方法特異性驗證結果Fig. 6Specificity verification results of the duplex fluorescent RPA method

2.4 雙重熒光RPA 方法靈敏度驗證結果

將建立好的IHHNV 陽性質粒和EHP 陽性質粒分別進行稀釋， 得到1×105、1×104、 1×103、1×102、1×101copies/μL 共5 個濃度梯度。 每個濃度模板分別測試3 個重復，以測試建立方法的靈敏度。 檢測結果如圖7 顯示，1×105~1×102copies/μL 的樣本均有明顯的擴增曲線，1×101copies/μL 的樣本擴增曲線接近水平。 可見建立的雙重熒光RPA 方法對IHHNV 陽性質粒和EHP 陽性質粒的檢測靈敏度可以達到1×102copies/μL。

2.5 雙重熒光RPA 方法重復性驗證結果

將建立好的IHHNV 陽性質粒和EHP 陽性質粒分別進行稀釋，混合至濃度均為2×103copies/μL，重復檢測10 個模板，來驗證方法的重復性，分別計算各自的CT 值的變異系數，IHHNV 檢測的CT 值分 別 為 20.12、19.54、19.01、19.83、19.72、19.53、20.03、19.89、19.47、19.88， 變異系數為1.65%；EHP檢測的CT 值分別為17.12、17.24、17.35、17.46、17.92、18.21、18.31、17.65、17.94、17.46，變異系數為2.32%。 具體結果如圖8 所示，雙重熒光RPA 方法對于IHHNV 和EHP 的重復性驗證結果較好。

圖8 雙重熒光RPA 方法重復性驗證結果Fig. 8 Repeatability verification results of the duplex fluorescent RPA method

2.6 實際樣本檢測及方法學對比結果

進口冷凍帶頭對蝦樣本共20 份， 每個樣本取5 μL 核酸分別采用建立的雙重熒光RPA 方法進行檢測， 同時每個樣本用熒光PCR 方法進行平行檢測。 由圖9 可以看出，采用雙重熒光RPA 檢測出1例EHP 陽性和1 例IHHNV 陽性。熒光PCR 方法檢測結果與雙重熒光RPA 方法結果一致（見圖10）。

圖9 雙重熒光RPA 方法檢測20 例實際樣本的結果Fig. 9 Results of 20 clinical samples detected by the duplex fluorescent RPA method

圖10 熒光PCR 方法檢測20 例實際樣本的結果Fig. 10 Results of 20 clinical samples detected by the fluorescent PCR method

2.7 討論

IHHNV 感染可以在對蝦生長的整個周期，對蝦感染IHHNV 后，可能會終身帶病毒，并通過垂直傳染途徑感染子代，或透過食物鏈和污染水質等引起水平感染[15-16]。 目前，蝦肝腸胞蟲的傳播越來越廣泛，有研究表明在中國、印度尼西亞、馬來西亞、越南、印度和泰國等國家均有檢出[17]。 EHP 感染在苗種培育和成蝦養殖階段均有出現，嚴重影響對蝦的生長速度和成蝦品質，給該產業帶來巨大的經濟損失，在亞洲地區每年損失上億美元[18]，特別是和其他疫病混合感染時，使對蝦疫情加重，增加致死率。

IHHNV 和EHP 兩種疫病都會引起對蝦生長緩慢，影響投入產出比，當幼蝦出現生長緩慢、死亡率高的情況時，就需要養殖人員快速和準確地判斷出病原，以及時作出預防和治療方案來減少發病引起的更大損失。 所以，對于這兩種疫病的區分檢測具有重要的臨床意義。 特別是當臨床出現混合感染的時候，建立IHHNV 和EHP 的雙重檢測方法可以為確定病原節省更多的時間。

澳大利亞作為全球動植物檢驗檢疫最嚴格的國家之一，一直以來對進口的生蝦仁、面包蝦、去頭蝦等產品采取嚴格的檢疫措施[19]，使養殖企業和生產企業的負擔加重，給我國蝦生產企業，乃至整個蝦產業造成了嚴重的經濟和社會影響，嚴重影響了對蝦進出口貿易和對蝦養殖產業的發展。 所以，針對冷凍水產品的疫病監測，全球各個國家所制定的檢疫措施也越來越嚴格。 因此，必須足夠地重視和關注原料、生產線及成品質量，加強企業對疫病檢疫的力度，降低企業的生產成本和出口風險。

王金鳳等構建了豬瘟病毒重組酶聚合酶擴增檢測方法（RT-RPA 方法），該方法的檢出限為1.0×102copies/μL[20]。 萬文妍等將重組酶聚合酶擴增（RPA）與膠體金側向流試紙條（LFD）技術聯合，建立了禽腺病毒血清4 型RPA-LFD 快速檢測方法， 該方法的最低檢出限為1.0×102copies/μL， 可用肉眼直接觀察結果[21]。 楊洋等建立了口蹄疫病毒實時熒光反轉錄重組酶聚合酶擴增檢測方法，該方法特異性較高， 重復性好， 靈敏度為5.0×102copies/μL，與RT-qPCR 檢測結果具有100%的符合率[22]。 作者從臨床應用考慮建立雙重熒光RPA 方法，對方法的特異性、靈敏度和重復性進行驗證，結果顯示所建立的方法只對IHHNV 和EHP 的核酸樣本有明顯的擴增， 而對其他病原和宿主基因均不會擴增；IHHNV 和EHP 陽性質粒的檢測靈敏度可以達到1×102copies/μL，表明方法的靈敏度較高。 同時，進行重復性驗證，結果顯示方法重復性較好。

目前，對于對蝦疫病的主流方法是熒光PCR 和普通PCR 方法[23-24]，這些方法均需要使用熒光定量PCR 儀和普通PCR 儀，設備需要使用220 V 交流電源，需要在實驗室環境下使用，不利于在野外實施檢測； 同時熒光定量PCR 方法需要循環升降溫，檢測時間比較長，一般需要1.0~1.5 h。

使用本文中建立的方法對進口凍蝦進行檢測，檢出1 例EHP 感染和1 例IHHNV 感染，同時用熒光PCR 方法進行比對檢測，兩種方法的檢測結果一致。 但是，雙重熒光RPA 方法中的弱陽性樣本擴增曲線效率更高，同時雙重熒光RPA 方法的檢測速度明顯短于熒光PCR 方法。

3 結 語

當前，疫病檢測的要求越來越嚴格，不僅要縮短檢測時間，還要提高檢測靈敏度，在這樣的要求下，需要開發出更多快速、簡便、靈敏度高的檢測方法。 重組酶聚合酶擴增技術是恒溫核酸擴增技術的一種，該方法靈敏、快速，有著廣闊的應用前景[25-27]。本研究中建立了同時檢測IHHNV 和EHP 的雙重熒光RPA 方法，不需要使用復雜的設備，在現場即可以檢測，并且檢測時間可以縮短到20~30 min。

目前， 對于雙重疫病RPA 檢測方法的報道較少，所以對于多重熒光RPA 方法的建立還需要更多的研究，比如較高要求的引物設計。 進行引物設計時，需要注意：RPA 的5′端3~5 個堿基處，最好是嘧啶堿基（T/C），不要出現G，嘧啶有利于引物與重組酶形成復合體；RPA 的3′端最好是G/C， 這樣引物與模板的結合更穩定。 本研究中建立的雙重熒光RPA 方法的引物、探針的設計是依據Twist Amp TM Basic Kit 中的說明書進行操作，首先找到一對堿基T，這對T 堿基被1~5 個堿基隔開，靠近5′端T 堿基被熒光基團取代，3′端T 堿基被淬滅基團取代，在隔開的中間堿基中挑一個用THF（tetrahydrofuran）取代；從5′端到熒光基團至少30 個堿基，從3′到淬滅基團至少15 個堿基，且3′端堿基需要被修飾。

雖然雙重熒光RPA 方法還有很多需要改進的地方，但是其不可忽視的特點和優勢會使該方法應用前景廣闊，對于臨床養殖場的病原篩查具有重要意義。