流過式介質電離質譜對郫縣豆瓣醬香氣物質的快速鑒別

傅小玲， 張 聰， 叢 夢， 萬如風， 李偉麗， 吳 韜

（西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039）

郫縣豆瓣醬是我國著名的傳統調味品，其在不同發酵時期具有顯著不同的香氣特征[1]。 豆瓣醬中香氣物質一部分來自原料，另一部分則由豆瓣醬中蛋白質類成分在微生物發酵過程中生成[2]。 目前市場上郫縣豆瓣醬的品質參差不齊，以次充好的現象時有發生，因此有必要根據不同發酵時期的香氣物質差異，采用儀器分析手段對郫縣豆瓣醬進行快速分級。 傳統的香氣物質檢測方法主要采用氣相質譜技術，以評估發酵時間對郫縣豆瓣醬香氣的影響[3-6]。然而，在氣相色譜分離過程中，存在著樣品預處理步驟煩瑣、 色譜柱老化和分離時間較長等弊端，不適合進行香氣物質的高通量快速鑒定。

流過式介質電離質譜（SICRIT-MS）是一種高通量質譜檢測技術，結構如圖1 所示。 它利用電極放電瞬間激發和電離質譜入口端的氣態化學物質，來實時識別流入的化學成分， 極大地簡化了分析步驟，縮短了檢測時間。 該技術的優勢還包括可以同時電離中弱極性、非極性的痕量及超痕量的靶向或非靶向標志物分子，大大提升樣品分子檢測覆蓋率[7]。

圖1 SICRIT-MS 結構圖Fig. 1 Structural diagram of SICRIT-MS

作者以不同發酵時期的郫縣豆瓣醬為樣本模型，采用SICRIT-MS 進行數據采集，并利用代謝組學手段對不同發酵時期的郫縣豆瓣醬特征香氣物質進行統計學分析[8]，期望建立一種快速、高效、準確地評價郫縣豆瓣醬品質的方法，為實現標準、智能和客觀的品質判定提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料豆瓣醬 （原料時期）、 曲瓣子 （曲瓣子時期）、后發酵（3、6、12 個月）樣品：成都市旺豐食品有限責任公司；高純氦氣（純度99.99%）、高純氮氣（純度99.99%）：成都龍泰工業氣體有限公司。

1.2 實驗儀器

SICRIT?SC-20 離子源： 德國Plasmion 公司；AB SCIEX 3500 三重四級桿質譜儀：美國AB Sciex公司；2020 NX GC-MS 儀：日本島津公司；SPME 手動進樣手柄： 上海安普實驗科技股份有限公司；HHS-21-4 電熱恒溫水浴鍋： 上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備及前處理將不同發酵時期豆瓣醬樣品，經凍干，打磨成粉，于-18 ℃保藏。測試時稱取適量凍干粉末樣品于EP 管中。

1.3.2 SICRIT-MS 分析SICRIT-MS 分析系統是由一個SICRIT 離子源串聯三重四級桿質譜儀組成。 將裝有樣品的EP 管打開，放置于SICRIT 離子源入口端3 s 進行質譜數據采集。 SICRIT 條件：放電高壓1 500 V。 質譜條件：正、負離子模式，去簇電壓（declustering potential，DP）40 V，碰撞能量（CE）10 V。 每個樣品進行5 次重復實驗。

1.4 數據處理及統計分析

采用Marker View 軟件對數據進行峰對齊、保留時間校正和峰面積提取。 在強度閾值為50、相對分子質量偏差為0.01、 保留時間為0.2 s 的條件下收集峰值。 以NIST17 數據庫進行輔助定性分析，確定成分的化學結構式及名稱。 處理后的數據經SIMCA-P 14.1 軟件進行多元數據分析,進行無監督的主成分分析（PCA）和有監督的正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。 將處理后的數據用IBM SPSS Statistics 25 軟件進行方差分析（ANOVA），同時滿足P＜0.05 和VIP＞1.0 的化合物為不同樣本的差異代謝化合物。

2 結果與分析

2.1 SICRIT-MS 的參數優化

當揮發性物質經過介質通路時，高壓放電產生的分子離子會瞬間被質譜檢測[9]。 為了提高檢測靈敏度，需要對質譜參數優化。由于DP 會顯著影響化合物電離效率[10]，因此通過測量樣品在正、負離子兩種模式下一級離子的響應強度來評價DP 對樣品檢測的影響。圖2（a）為樣品在正離子模式下一級離子的響應強度，DP 在20~40 V 時呈現上升趨勢，DP為40 V 時，響應強度達到最高；DP 大于40 V 后呈現下降趨勢。圖2（b）為樣品在負離子模式下一級離子的響應強度，DP 為20~30 V 時呈現上升趨勢；DP為30~40 V 時變化不明顯，趨于穩定狀態；DP 為40~60 V 時呈現下降趨勢，且在DP 大于40 V 后離子響應強度迅速下降。 在正、負離子模式下一級離子的響應強度均在DP 為40 V 時最佳。 因此，選擇40 V 作為最佳的去簇電壓。

圖2 SICRIT-MS 測定豆瓣醬方法優化Fig. 2 Optimization of method for determination of broad-bean paste by SICRIT-MS

2.2 香氣物質的主成分分析

主成分分析（PCA）是一種常見的數據分析方式[11]，把多個指標轉化成少數綜合指標的一種多元數據統計方法[12]。 如圖3 所示，PC1、PC2 和PC3 分別代表3 個主成分，不同顏色散點表示不同發酵時期豆瓣醬。 從圖中可以看，主成分分別解釋了正離子模式和負離子模式下總變異的64.6%和73.7%。 在正離子模式3D-PCA 得分圖中可以看到原料豆瓣醬和曲瓣子較接近（見圖3（a）），說明兩者在揮發性物質上有一定相似性。 后發酵12 個月樣品則與3 個月以及6 個月樣品有明顯的區分， 后發酵12 個月樣品揮發性物質發生了顯著變化。 從負離子模式3D-PCA 得分圖中可以看到（見圖3（b）），原料豆瓣醬與曲瓣子沒有顯著的區分，說明在這兩個發酵時期的豆瓣醬中揮發性物質有一定的相似性。 后發酵3、6、12 個月樣品有明顯的分離， 其中后發酵12 個月樣品依然區分明顯。

圖3 SICRIT-MS 正、 負離子模式下豆瓣醬樣品的3DPCA 得分圖Fig. 3 PCA score of broad-bean paste samples under positive and negative ion modes of SICRIT-MS

本實驗中，ESI－數據生成的PCA 模型的質量（R2=0.834，Q2=0.587） 要優于ESI+（R2=0.735，Q2=0.462）。 根據正、負離子模式下PCA 得分圖可以看出豆瓣醬在發酵過程中隨著發酵時間的延長其揮發性物質有明顯的變化，通過后期的不斷發酵才形成了豆瓣醬的獨特風味。

2.3 SICRIT-MS 鑒定豆瓣醬的差異特征化合物

使用正交偏最小二乘判別分析 （OPLS-DA）生成S-plot 圖，對數據進行進一步挖掘[13]。在建立模型時預先提供了豆瓣醬的分組信息，充分提取豆瓣醬在5 個發酵時期樣本間的差異信息，能夠更加有效降低組內個體差異對模型的影響，有利于排除在發酵過程中由無關變量引起的組間差異放大，同時增強模型的解釋能力。

通過SICRIT-MS 數據獲得的OPLS-DA 得分圖如圖4 所示。 在OPLS-DA 中，3 個主成分分別解釋了正離子模式和負離子模式下總變異的64.8%和73.7%。

圖4 SICRIT-MS 正、負離子模式下豆瓣醬樣品的OPLSDA 得分圖Fig. 4 OPLS-DA score of broad-bean paste samples under positive and negative ion modes of SICRIT-MS

通過參數指標對模型質量進行評估，ESI+模式下R2y（cum）=0.957，ESI-模式下R2y（cum）=0.934，以及ESI+模式下Q2（cum）=0.925，ESI-模式下Q2（cum）=0.896， 說明在兩種采集模式下所得數據建立的OPLS-DA 模型都擬合了較多的信息， 具有良好的預測能力，且Q2均大于0.850，進一步說明了模型的可靠性與預測性。

為了更加有效地防止發生過度擬合的情況，運用置換檢驗來驗證模型的有效性[14]。 圖5 為200 次循環迭代置換檢驗的結果。 通過原始模型與置換檢驗得出的數據進行比較，ESI+模式下，Q2=-0.424，ESI－模式下，Q2=-0.407， 最右側Q2大于左側任何一個y變量隨機排列模型的Q2，并且在y軸上的截距小于0，則認為模型質量較好，沒有出現過擬合情況[15]。Q2的回歸直線與y軸的交點在負半軸，可以說明建立的OPLS-DA 模型是穩健可靠的。

圖5 OPLS-DA 模型的200 次循環迭代置換檢驗結果Fig. 5 Results of 200 cyclic permutation tests of OPLSDA model

為了研究不同發酵時期豆瓣醬的差異性，對其進行特征化合物的篩選與鑒定，這是本研究的重要環節之一。上述實驗中通過SICRIT-MS 獲得的數據經OPLS-DA 后，樣本得到很好區分，模型具有良好的可靠性與預測性。 采用S-plot 圖選擇差異變量，以VIP 值大于1.0 為標準，選擇對模型有較大影響的變量[16]，并以P＜0.05 作為標準篩選差異變量[17-18]，對差異變量的均值進行t檢驗。 VIP 值即空間投影重要性或者差異權重貢獻值，它反映了每個變量對豆瓣醬發酵樣本分類判別的影響，以及對模型解釋的貢獻度。通常認為數值大于1.0 時，變量對組間分離具有顯著貢獻。 進一步對VIP 值大于1.0 的變量進行方差分析（ANOVA），采用最小差異（LSD）方法確定樣本均值之間的差異。 最終在正離子模式下篩選出18 個差異碎片離子， 在負離子模式下篩選出11 個差異碎片離子，結果見表1。

表1 基于SICRIT-MS 正、負離子模式下差異碎片離子篩選結果Table 1 Screening results of differential compounds in positive and negative ion modes based on SICRIT-MS

2.4 豆瓣醬SICRIT-MS 差異碎片離子聚類分析

聚類分析是一種無監督模式的識別方法[19]，可以驗證數據的有效性，輔助建立預測模型，有利于進一步了解豆瓣醬在發酵過程和不同發酵時期揮發性風味化合物的變化。 將SICRIT-MS 在正、負離子測定模式下所得碎片離子的相對分子質量與GC-MS 建立的數據譜庫進行比對，輔助SICRIT-MS對不同發酵時期豆瓣醬的揮發性物質進行定性。正、負離子模式下差異碎片離子的聚類分析結果如圖6 所示。

圖6 SICRIT-MS 正、負離子模式下豆瓣醬樣品的聚類分析熱投射圖Fig. 6 Thermal projection diagram of cluster analysis of broad-bean paste samples under positive and negative ion modes of SICRIT-MS

通過對5 個發酵時期豆瓣醬的揮發性物質進行檢測， 測定出的揮發性呈香物質主要為醇類、醛類、酯類、酸類、酚類、酮類、烴類及芳香烴類。 豆瓣醬在發酵過程中，由于蛋白酶的水解作用，使得游離氨基酸增加， 其中羰基和游離的氨基酸發生Maillard 以及Streeker 反應[20]，形成了酯類、醛類、酚類、醇類等揮發性物質[21-23]。 酯類、醇類在正離子模式下更易得到H+形成[M+H]+，因此，在正離子模式下能得到更豐富的化合物信息[24]。

在正離子模式下，選取豆瓣醬在發酵過程中可初步檢測到的相對含量變化較為突出的18 個差異碎片離子，進行聚類分析。3-苯丙酸-2-苯乙基酯和己醛兩種物質隨著發酵時間延長， 相對含量減少。己酸乙酯和芳樟醇兩種物質相對含量在曲瓣子時期最多，再隨著發酵時間增加而消失，可將己酸乙酯為曲瓣子時期特征香氣物質。 大部分乙酯含果味和甜味，有助于豆瓣醬中風味的形成[25]。豆瓣醬后發酵3 個月時期特征香氣物質為（4S）-4-甲基-1-己醇和癸酸乙酯。 苯乙醛和正戊酸乙酯為豆瓣醬后發酵6 個月時期特征香氣物質。 2-苯基-2-丁烯醛和丙酸-2-苯乙酯相對含量隨著發酵時間延長而增多，在豆瓣醬后發酵12 個月時期最多。 乙酸三聯酯只在原料豆瓣醬和曲瓣子中檢測出，可作為區分后發酵豆瓣醬的特征性風味物質。 在正離子模式下，可以通過以上較明顯的揮發性物質的檢測來判斷豆瓣醬發酵的階段，從而判斷豆瓣醬的最佳發酵時間。 在不同發酵時期檢測到的最突出物質是提供豆瓣醬當前時期的主要風味物質，這些物質在其他豆瓣醬發酵時期的相對含量均處于穩定狀態，無明顯的變化。

在負離子模式下，選取豆瓣醬在發酵過程中可初步檢測到的相對含量變化較為顯著的11 個差異碎片離子進行聚類分析。 其中，對二甲苯是原料豆瓣醬中的特征性風味物質。 而在曲瓣子時期，3-辛烯-2-酮是主要香氣成分， 此外芳樟醇的相對含量也較高。 芳樟醇既有紫丁香、鈴蘭花香，又有果香氣息[26]，為豆瓣醬發酵時香氣形成提供了一定的貢獻。醇類化合物都具有特殊香氣， 且芳香閾值較低，對其他成分具有促進作用[27]。隨著發酵時間延長，豆瓣醬后發酵3 個月時甲基丙烯酸異戊酯、己酸乙酯相對含量增加。 豆瓣醬后發酵6 個月時產生新物質1，1-二乙氧基-3-甲基丁烷。 豆瓣醬后發酵12 個月時異戊酸異丁酯、4-乙基愈創木酚和苯乙酸乙酯生成， 作為后發酵12 個月時期豆瓣醬的特征性風味物質。 在豆瓣醬發酵過程中產生的酸類、酚類等化合物也是豆瓣醬不可或缺的風味物質，起到調節風味的作用，而酸類、酚類化合物在負離子模式下更易失去H+離子形成[M-H]-[28]。

在豆瓣醬發酵的5 個時期，酯類化合物的種類最多，作為豆瓣醬的主要呈香物質，酸和醇的酯化反應是形成酯的主要反應[29]。 醛類和酮類化合物都是羰基類的化合物， 由醇氧化和酸還原得到的，屬于不穩定的化合物， 在豆瓣醬發酵過程中種類少，但提供了豆瓣醬花果香的獨特風味[30]。 烴類化合物主要由烯烴類化合物組成， 同時含有少量的烷烴，烴類化合物大多數不具備香味， 風味閾值較高，對豆瓣醬的風味貢獻較少。 豆瓣醬中的烯烴類化合物，風味閾值較高，對豆瓣醬的風味貢獻較大。 芳香烴類化合物種類最少，但其因為呈味閾值較小[31]，本身可能具有發酵豆制品的獨特風味，對豆瓣醬的醇厚風味的形成有直接的影響[32]。

3 結 語

本研究中首次成功將SICRIT-MS 技術與代謝組學技術相結合，創立了一種快速評估郫縣豆瓣醬發酵過程中香氣物質的方法，在質譜正離子模式下篩選出18 個差異成分， 在負離子模式下篩選出11個差異成分，為郫縣豆瓣醬的發酵和數字化生產提供了技術支持。