預測艱難梭菌感染的列線圖模型構建

王麗倩 單繼康 趙豐 杜一芃 周遠弟 王賢軍

艱難梭菌為革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，艱難梭菌感染（Clostridioides difficile infection，CDI）的臨床癥狀包括腹瀉、偽膜性腸炎、中毒性巨結腸、敗血癥甚至死亡等［1］。近年，與 CDI 相關的發病率和死亡率急劇上升，這使得艱難梭菌成為新興病原體之一，CDI 患者死亡率6.9%～16.7%［2-3］。然而，由于目前我國艱難梭菌實驗室診斷能力不足［4］，且檢測成本昂貴，導致艱難梭菌檢測無法在臨床常規開展。因此，分析腹瀉患者中CDI 的高危因素，建立預測模型初篩CDI，對于降低CDI 的漏檢率有重要意義。本研究擬通過腹瀉患者的常規檢查如糞常規、血常規和血生化，評估腹瀉患者中CDI 的高危因素，并建立列線圖預測模型。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2015 年8 月至2019 年7 月浙江大學醫學院附屬杭州市第一人民醫院1,055例腹瀉患者的臨床資料。納入標準：腹瀉＞48 h；腹瀉＞3 次/d。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法（1）收集資料：包括性別、年齡、糞常規、血常規和血生化等指標。（2）艱難梭菌培養鑒定：①標本接種：挑取200 μL 腹瀉樣本于EP 管中，加800 μL無水乙醇通過漩渦振蕩至混勻。靜置1 h 后將裝有腹瀉樣本的EP 管以8,000 rpm/min 離心4 min，棄上清，加0.9%氯化鈉溶液500 μL 稀釋液懸浮沉淀物，將其倒入艱難梭菌選擇性培養基涂布。將培養基和厭氧發生指示劑放于厭氧罐，將厭氧罐置于37℃的CO2培養箱厭氧培養48 h。②質譜鑒定：采用直接涂布法，即挑取可疑菌落（灰色中等大小，邊緣不整齊，略凸起表面粗糙的菌落）涂布于加樣平板上，覆蓋70%甲酸1 μL，待其干燥后再覆蓋1 μL 基質液（HCCA 溶液）。待基質液干燥后，將加樣板放入質譜儀檢測。質譜儀采集相對分子量2,000～20,000 Da 樣本蛋白圖譜，通過Bruker Biotyper 3.0 軟件與數據庫進行比較，自動顯示鑒定結果。③菌株保存：使用無菌棉棒挑取分純后的菌株，混勻溶解于含20%甘油的BHI 培養液，放置于低溫冰箱-70℃保存。（2）艱難梭菌分子學檢測：參照《分子克隆實驗指南》和Qiagen 試劑盒說明提取艱難梭菌基因組DNA 模板，毒素基因 tcdA 和 tcdB 使用先前報道的引物序列［5］通過傳統的聚合酶鏈反應進行測定。（3）CDI 診斷標準：參照《中國成人CDI 診斷和治療專家共識》［6］，CDI 診斷標準：患者出現中至重度腹瀉或腸梗阻，并滿足以下任一條件：（1）糞便艱難梭菌毒素或產毒艱難梭菌結果陽性；（2）內鏡下或組織病理檢查顯示偽膜性腸炎。

1.3 統計分析方法 采用SPSS22.0 統計學軟件。采用多因素Logistic 分析篩選CDI 的危險因素，將該危險因素引入R 軟件構建列線圖，并繪制受試者操作特征（ROC）曲線預評估模型區分度。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CDI 患者與非CDI 患者檢驗資料比較 兩組患者中性粒細胞百分比、總蛋白、白蛋白和鉀離子濃度差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 CDI患者與非CDI患者檢驗資料比較［n（%）］

2.2 腹瀉患者中CDI 發生危險因素的多因素logistic 回歸分析中性粒細胞百分比、總蛋白濃度和鉀離子濃度是腹瀉患者中CDI 發生的獨立危險因素（P＜0.05）。見表2。

表2 腹瀉患者中CDI發生危險因素的多因素Logistic回歸分析

2.3 腹瀉患者中CDI 發生風險列線圖模型的建立 將腹瀉患者中CDI 發生的危險因素和前期研究發現的獨立危險因素年齡（＞55 歲）［5］納入R 軟件構建列線圖預測模型，各因素積分之和對應的預測概率即為腹瀉患者中艱難梭菌為致病菌的風險值。列線圖顯示，腹瀉患者中艱難梭菌為致病菌的風險：年齡＞55 歲為30 分，中性粒細胞＜70%為97 分，總蛋白＜65 g/L 為58 分，鉀離子濃度＜3.5 mmlo/L 為57 分。見圖1。列線圖預測腹瀉患者中CDI 的ROC 曲線下面積為0.717。見圖2。

圖2 列線圖預測腹瀉患者中CDI的ROC曲線

3 討論

艱難梭菌引起的腹瀉在國外尤其北美洲、歐洲和澳洲屢見不鮮。近年來，亞洲地區的日本、韓國及我國也相繼出現多種基因型的CDI 病例［7］。因此有必要在臨床常規開展產毒型艱難梭菌檢測。但我國艱難梭菌臨床檢測費用昂貴，操作復雜，嚴重制約該檢測在臨床廣泛開展，從而影響CDI 的診療工作［8］。前期研究已發現艱難梭菌分型與腹瀉嚴重程度的相關性［9-10］，同時建模已在臨床診斷中逐漸開展應用［11］。

列線圖通過整合不良事件發生風險，對不良事件的貢獻度進行可視化展示，臨床可針對列線圖篩選出的高危患者給予個體化預防措施。本研究結果顯示，中性粒細胞百分比、總蛋白濃度和鉀離子濃度是腹瀉患者中發生CDI 的獨立危險因素，基于上述獨立危險因素和文獻中報道的高齡危險因素［5］建立列線圖預測模型，ROC 曲線下面積為0.717。表明該列線圖預測腹瀉患者中CDI 的發生風險具有一定的臨床指導價值。

本研究顯示，患者總蛋白含量與CDI 發生率密切相關。該結果與KUMARAPPA 等［12］研究相符，CDI 患者常伴隨低總蛋白，一方面由于腹瀉導致蛋白流失，另一方面低總蛋白會增加患者面臨CDI 的風險，因低蛋白伴隨低白蛋白或低血清免疫球蛋白，而低免疫球蛋白導致患者抗毒素抗體免疫反應差，阻礙了宿主對艱難梭菌的免疫反應，從而導致艱難梭菌在患者腸道內大量增殖而致病［13］。本研究發現低鉀離子與CDI 發生率有關，由于腹瀉導致鉀離子流失。本研究中CDI 患者的陽性率為17.2%，高于金大智等［5］報道的10.0%，低于程敬偉等［14］報道的24.3%，目前國內外有關CDI 的發生率差異較大，提示我國CDI 可采用早發現早治療的方法降低院感，從而進一步降低發生率。

綜上所述，基于腹瀉患者中CDI 的危險因素建立的列線圖預測模型具有較好的區分度，可為CDI 的初篩提供一定的指導，早發現、早診斷、早治療。后期擬計劃將列線圖預測模型通過大數據用于腹瀉患者中篩選CDI。