LRP1在消化系統(tǒng)惡性腫瘤侵襲和預(yù)后中的調(diào)節(jié)作用

朱萌瑛 沈浩 汪碧麗 何鎣飛 陳瑾 任軍 章浙忠 許健

消化系統(tǒng)惡性腫瘤是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，包括食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌和胰腺癌［1］。消化系統(tǒng)癌癥占全球癌癥發(fā)病率的26%，占所有癌癥相關(guān)死亡的35%［2］。因此，探尋能夠調(diào)控消化系統(tǒng)惡性腫瘤進(jìn)展和預(yù)后的生物標(biāo)志物是臨床提高治療效果的關(guān)鍵。目前，手術(shù)切除是消化系統(tǒng)惡性腫瘤早期治療的主要方法［3］。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（Low-density lipoprotein receptor-related Protein-1，LRP1）作為膜上的內(nèi)吞受體，在腫瘤侵襲中起重要作用［4］，有研究證明，LRP1 高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［5-8］。而表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）則與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，激活的Akt 則促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力。本研究探討LRP1 敲低對(duì)消化系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析 從GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)下載正常胃、胰腺和肝臟的RNA-seq 數(shù)據(jù)，從TCGA 的Xena 門戶網(wǎng)站下載胃、胰腺和肝臟腫瘤的RNA-seq 數(shù)據(jù)。采用R（3.6.3 版）軟件中g(shù)gplot2（3.3.3 版）、survival（3.2.10版）、survminer（0.4.9 版）和pROC（1.17.0.1 版）軟件包進(jìn)行分析。

1.2 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng) HGC-27 細(xì)胞、HepG2 細(xì)胞、BxPC-3 細(xì)胞、PANC-1 細(xì)胞、CaCO2細(xì)胞、HUVEC 細(xì)胞來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（上海）。細(xì)胞在添加了10%胎牛血清（FBS，Hyclone，Thermo Fisher Scientific，Inc，UT，USA）的Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基（DMEM，Gibco，Grand Island，NY，USA）或RPMI-1640（Gibco，Grand Island，NY，USA）中培養(yǎng)。所有細(xì)胞系在37℃5% CO2培養(yǎng)。

1.3 蛋白免疫印跡分析 采用一抗LRP1（1 ∶10,000，Abcam）、ERK1/2（1 ∶10,000，Abcam）、phospho-ERK1/2（1 ∶10,000，Abcam）、AKT（1 ∶10,000，Abcam）、phospho-AKT（1 ∶10,000，Abcam）、EFGR（1 ∶10,000，Abcam）、MMP2（1 ∶10,000，Abcam）、MMP9（1 ∶10,000，Abcam）、GAPDH（1 ∶10,000，Abcam）、PI3K（1 ∶5,000，Abcam）、P-PI3K（1 ∶10,000，Abcam）進(jìn)行Western blot 檢測(cè)。采用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）或抗兔IgG抗體作為二抗（1：500，Multi Sciences Biotech Co.Ltd），采用化學(xué)發(fā)光（ECL）蛋白印跡法（western blot）底物（Multi Sciences Biotech Co.Ltd）進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 細(xì)胞毒性和增殖實(shí)驗(yàn) 采用Alexa Fluor 594（碧云天，Cat.594）試劑盒進(jìn)行EdU-594 染色（碧云天，Cat.No：C0078S）。在熒光顯微鏡（IX71，Olympus Corporation）下觀察結(jié)果，比較LRP1 敲低前后細(xì)胞增殖的變化。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn) 克隆形成實(shí)驗(yàn)中，選擇LV-LRP1-RNAi 和LV-siNC 感染的細(xì)胞，以每孔1,000 個(gè)細(xì)胞的密度轉(zhuǎn)移至6 孔板。將shNC 和shLRP1 慢病毒接種于6孔板，培養(yǎng)15 d。菌落用戊二醛（6.0% v/v）固定，結(jié)晶紫（0.5% w/v）染色后觀察并拍照。

1.6 Transwell 實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn) 采用Matrigel 基質(zhì)膠進(jìn)行Transwell 實(shí)驗(yàn)，并按照Transwell 試劑盒（Corning，NY，USA）的說(shuō)明書進(jìn)行。將細(xì)胞重懸于含BSA 的無(wú)血清培養(yǎng)基中，Transwell 上室中心加入200 μL（5,000個(gè)細(xì)胞），下室加入含20% FBS 的培養(yǎng)基500 μL，置于37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中12～48 h。將Transwell板培養(yǎng)液棄去，用4%多聚甲醛固定15 min，最后加入1 mL 結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下觀察結(jié)果。在劃痕實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞在6 孔板中培養(yǎng)至融合（80%），然后用微管尖端劃痕。更換1 次/12 h，含10% FBS 的新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基。于0 h、48 h 用顯微鏡連續(xù)監(jiān)測(cè)劃痕愈合面積。

1.7 HE 染色和免疫組織化學(xué)分析 石蠟切片來(lái)自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院。免疫組化分析按照廠家提供的Histostain-SP 試劑盒方案進(jìn)行（SP-0023，Bioss，北京，中國(guó)）。采用以下一抗進(jìn)行免疫組化：抗LRP1 抗體（1 ∶100，Abcam）。采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗作為二抗（1 ∶100 dilution，Multi Sciences Biotech，杭州，中國(guó)），結(jié)果在Olympus BX41 顯微鏡下觀察。

1.8 慢病毒轉(zhuǎn)染敲降LRP1 重組慢病毒LV-LRP1-RNAi（60326-2）和陰性對(duì)照病毒LV-CON077 購(gòu)于吉?jiǎng)P基因（GENE，上海，中國(guó)）。慢病毒敲降BxPC-3、HepG2 和HGC-27 細(xì)胞中的LRP1 基因按照吉?jiǎng)P基因公司提供的重組慢病毒載體使用手冊(cè)進(jìn)行。細(xì)胞與慢病毒孵育24 h，經(jīng)嘌呤霉素（ST551-10，Beyotime，中國(guó)）篩選后進(jìn)行Western blot 檢測(cè)驗(yàn)證敲降水平。

2 結(jié)果

2.1 LRP1 在消化系統(tǒng)惡性腫瘤的表達(dá)及預(yù)后分析 對(duì)LRP1 進(jìn)行泛癌分析（見(jiàn)圖1A），結(jié)果顯示LRP1在胃腺癌（STAD）和胰腺癌（PAAD）中高表達(dá)（見(jiàn)圖1B）。Cox 回歸分析顯示，在STAD 中LRP1 高表達(dá)提示患者預(yù)后不良，P＜0.01（見(jiàn)圖1C）。在預(yù)測(cè)腫瘤結(jié)局方面，LRP1 在PAAD 中具有更高的準(zhǔn)確性（AUC：0.964，95%CI：0.942～0.986）（見(jiàn)圖1D）。

圖1 生物信息學(xué)分析。A.各種癌癥和正常標(biāo)本中LRP1表達(dá)譜的條形圖。B.TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中胃、胰腺、肝臟腫瘤組織和正常組織中LRP1的表達(dá)水平。C.LRP1與STAD、PAAD和LIHC預(yù)后的相關(guān)性。D.LRP1在STAD、PAAD和LIHC中的ROC曲線。E.HE染色（×200）的胃癌組織、肝癌組織、胰腺癌組織。F.應(yīng)用LRP1抗體對(duì)胃癌組織、肝癌組織和胰腺癌組織進(jìn)行免疫化學(xué)染色，棕色為L(zhǎng)RP1蛋白

2.2 LRP1 在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中高表達(dá) 在組織水平對(duì)LRP1 在腫瘤組織高表達(dá)進(jìn)行初步驗(yàn)證，與正常胃腸道組織相比，LRP1 在胃癌、肝癌、胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)（見(jiàn)圖1E-F）。

2.3 LRP1 在HGC-27、HepG2 和BxPC-3 細(xì)胞中高表達(dá) 選用5 株消化系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞系（CaCO2、BxPC-3、Panc-1、HGC-27、HepG2）并以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC 為對(duì)照，通過(guò)Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LRP1 在不同消化系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，與HUVEC 細(xì)胞相比，LRP1 在胃癌HGC-27 細(xì)胞、肝癌HepG2 細(xì)胞和胰腺癌BxPC-3 細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高。通過(guò)Image J 和SPSS 19.0 軟件分析，BxPC-3 細(xì)胞與HUVEC 細(xì)胞相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HGC-27 細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞與HUVEC 細(xì)胞相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（見(jiàn)圖2A-B）。通過(guò)LV-LRP1-RNAi技術(shù)在HGC-27 細(xì)胞、HepG2 細(xì)胞和BxPC-3 細(xì)胞中敲低LRP1，shNC 作為對(duì)照，Western blot 結(jié)果顯示，與shNC 細(xì)胞相比，shLRP1 細(xì)胞中的LRP1 表達(dá)水平降低（見(jiàn)圖2C-D）。

圖2 LRP1在BxPC-3、HepG2和HGC-27細(xì)胞中高表達(dá)。A-B.Western blot檢測(cè)HUVEC、CaCO2、BxPC-3、PANC-1、HGC-27和HepG2細(xì)胞中LRP1蛋白與對(duì)照GAPDH的表達(dá)量，LRP1蛋白相對(duì)表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)圖。*P＜0.05，**P＜0.01，****P＜0.0001。C-D.Western blot檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染前后HGC-27、HepG2和BxPC-3細(xì)胞中LRP1蛋白的表達(dá)量

2.4 降低LRP1 表達(dá)可抑制消化系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖 通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)和Edu 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)研究LRP1 敲降后對(duì)消化系統(tǒng)惡性腫瘤BxPC-3 細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和HGC-27 細(xì)胞增殖的影響。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與shNC 組相比，LRP1 敲低有效抑制三株消化系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖（見(jiàn)圖3A-B）。在Edu-594 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，三株敲低了LRP1 的腫瘤細(xì)胞增殖明顯抑制（見(jiàn)圖3C）。Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HGC-27 細(xì)胞、HepG2 細(xì)胞和BxPC-3 細(xì)胞中P-AKT、P-PI3K、EGFR 蛋白表達(dá)受到抑制（見(jiàn)圖3D-E）。

圖3 降低LRP1表達(dá)可抑制消化系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖。A-B.慢病毒轉(zhuǎn)染BxPC-3細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和HGC-27細(xì)胞前后克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)圖。C.EdU-594細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖中熒光顯微鏡的放大倍數(shù)為200倍。D-E.Western blot法檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染前后BxPC-3、HepG2和HGC-27細(xì)胞中p-AKT、AKT、P-PI3K、PI3K和EGFR蛋白的表達(dá)及小提琴圖。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

2.5 降低LRP1 表達(dá)可抑制消化系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移 劃痕實(shí)驗(yàn)和Tanswell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LRP1敲低后BxPC-3 細(xì)胞、HepG2 細(xì)胞和HGC-27 細(xì)胞的侵襲和遷移能力下降。與shNC 組相比，敲低LRP1 后BxPC-3、HepG2 和HGC-27 細(xì)胞在48 h 后劃痕面積愈合速度明顯減慢（見(jiàn)圖4A-B）。在Transwell 實(shí)驗(yàn)中，shLRP1 組的三株消化系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲能力表現(xiàn)出顯著降低（見(jiàn)圖4C-D）。Western Blot 結(jié)果顯示，LRP1 敲低后，BxPC-3 細(xì)胞、HepG2 細(xì)胞和HGC-27 細(xì)胞中P-ERK 和MMP-9 蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)。BxPC-3 細(xì)胞中ERK 和MMP-2 蛋白表達(dá)明顯下降（見(jiàn)圖4E）。

圖4 降低LRP1表達(dá)可抑制消化系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。A-B.慢病毒轉(zhuǎn)染前后BxPC-3細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和HGC-27細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯微鏡放大倍數(shù)為100倍。C-D.慢病毒轉(zhuǎn)染前后BxPC-3細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和HGC-27細(xì)胞的Transwell結(jié)果，圖中顯微鏡放大倍數(shù)為200倍。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直方圖。**P＜0.01

3 討論

近年來(lái)，消化系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病率在全球呈上升趨勢(shì)。消化系統(tǒng)惡性腫瘤的生存率與腫瘤發(fā)展階段密切相關(guān)。在消化系統(tǒng)惡性腫瘤早期診斷并介入治療，患者生存率和預(yù)后顯著提高。然而，目前臨床上對(duì)消化系統(tǒng)惡性腫瘤的診斷存在滯后性，這是由于消化系統(tǒng)惡性腫瘤缺乏早期癥狀導(dǎo)致早期診斷困難。CA199［9］、CA125［10］等是現(xiàn)有的診斷消化系統(tǒng)惡性腫瘤的標(biāo)志物，但這些標(biāo)志物與腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲和預(yù)后的關(guān)系尚不明確。因此，尋找有效的治療靶點(diǎn)和新的生物標(biāo)志物顯得尤為重要。基于生物信息學(xué)方法，消化系統(tǒng)惡性腫瘤中LRP1 高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)。LRP1 在消化系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞株（BxPC-3、HepG2 和HGC-27 細(xì)胞）中高表達(dá)，下調(diào)LRP1 的表達(dá)改變消化系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。EdU-594 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，敲低LRP1 后胃癌HGC-27 細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞和胰腺癌BxPC-3 細(xì)胞的增殖受到抑制。此外，敲低LRP1 后，細(xì)胞群體依賴性增加，抑制細(xì)胞克隆的形成。為進(jìn)一步明確降低LRP1 表達(dá)抑制消化系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制，采用Western blot 檢測(cè)AKT、PI3K和EGFR 蛋白的表達(dá)。LRP1 的低表達(dá)抑制AKT 和PI3K的磷酸化和EGFR 蛋白的表達(dá)。AKT 是主要的生存信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，是EGFR 的下游靶點(diǎn)。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP2 和MMP9）被認(rèn)為是與腫瘤侵襲和遷移相關(guān)的蛋白酶［11］。LRP1 介導(dǎo)的MMP 表達(dá)調(diào)控促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲［12］。LRP1 作為MMP2 和MMP9 的內(nèi)吞受體，從而調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲和遷移。有研究發(fā)現(xiàn)，LRP1 能誘導(dǎo)MMP2 和MMP9 表達(dá)，從而促進(jìn)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞遷移和侵襲。敲降LRP1 細(xì)胞中MMP2 和MMP9 的表達(dá)被選擇性降低［13］。本研究中，敲降LRP1 后胃癌HGC-27 細(xì)胞、肝癌HepG2 細(xì)胞和胰腺癌BxPC-3 細(xì)胞中ERK、MMP2 和MMP9 的表達(dá)減少。Transwell 和劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，HGC-27 細(xì)胞、HepG2 細(xì)胞和BxPC-3 細(xì)胞的侵襲和遷移能力均降低。ERK 信號(hào)通路可向細(xì)胞核傳遞細(xì)胞外刺激，調(diào)控腫瘤的發(fā)生、增殖、凋亡和耐藥［14-15］。

綜上所述，LRP1 在BxPC-3、HGC-27、HepG2 細(xì)胞中高表達(dá)，LRP1 高表達(dá)與消化系統(tǒng)惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，并促進(jìn)消化系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖。敲低LRP1 表達(dá)可能干擾腫瘤細(xì)胞脂質(zhì)代謝過(guò)程，導(dǎo)致EGFR、p-AKT 和p-ERK 蛋白降低，抑制膜分子MMP2和MMP9 蛋白表達(dá)，從而抑制消化系統(tǒng)惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲。降低LRP1 表達(dá)可抑制消化系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，提示LRP1 可能成為治療消化系統(tǒng)惡性腫瘤的新靶點(diǎn)。