基于A-to-I RNA編輯的列線圖預測肺腺癌患者的總生存期

朱鑫杰 包德榮 徐玉芬

肺癌是世界上病死率較高的惡性腫瘤之一［1］。而肺腺癌（LUAD）占所有肺癌診斷的50%，近年來其比例不斷增加［2］。盡管早期檢測和個體化治療已經得到有效發展，但相當一部分患者仍會出現復發和不良臨床結局［3］。近年來大量研究應用基因表達建立腫瘤預后預測模型來判斷腫瘤患者的預后情況［4-7］，由于基因表達的移動性和檢測不穩定性，其可靠性仍有待考量。RNA 編輯（RNA editing）是指在轉錄后水平上發生的核苷酸插入、缺失或替代，導致核苷酸序列發生改變，使其翻譯的蛋白質氨基酸序列、結構、功能或表達水平等不同于原基因序列所攜帶遺傳信息的生物學現象。迄今為止，人類已經發了超百萬個C-to-U、U-to-C、A-to-Ⅰ等RNA 編輯現象［8-10］。RNA 編輯相較于基因表達更有腫瘤特異性［11］，這使得其在預測預后和潛在治療位點方面有巨大潛力。在此，作者建立了一個應用ATIRE 預測LUAD 患者總生存期（OS）的預測模型。初步探索這些ATIRE 位點影響LUAD 存活的潛在機制。

1 資料與方法

1.1 資料收集 從TCGA 數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載LUAD 患者腫瘤組織和正常組織的轉錄組數據和臨床信息。TCGA 肺腺癌數據庫有54 個為正常樣本，501 個為腫瘤樣本。用PERL 軟件提取臨床信息，包括：樣品名稱、生存時間、生存狀態、年齡、性別、分級、分期。從Synapse 網站（https：//www.synapse.org/#!Synapse：syn2374375/files/）下載TCGALUAD 樣品的RNA 編輯數據，并采用PERL 軟件刪除缺失值＞30%的數據。刪除表達量過低的樣本，然后將RNA 編輯數據和生存數據合并。

1.2 預后模型的構建 501 個腫瘤樣本中22 個因缺少對應的ATIRE 數據被排除，故僅有479 個樣本被納入本研究，并采用R 軟件中的createDataPartition 函數將樣本按照6 ∶4 隨機分為建模組（n=288）和驗證組（n=191）。通過單因素COX 回歸分析初篩肺腺癌患者預后相關RNA 編輯，再通過套索算法（least absolute shrinkage and selection operator，Lasso）回歸對建模組的肺腺癌患者預后相關RNA 編輯進行降維，并利用多元逐步COX回歸模型篩選出最優的RNA編輯構建肺腺癌的預后模型，得到模型的公式，并獲得每個樣本的風險分數（Risk score）。基于獲得Risk score 的中位數，將建模組患者分為高風險組及低風險組。同時將驗證組的樣品根據Risk score 中位數，劃分為高低風險兩組。應用建模組的數據對預測模型進行檢驗，并采用ROC 曲線及校正曲線顯示預測模型在建模組和驗證組中預測模型的效能。采用Kaplan-Meier 法對建模組、驗證組進行生存分析以及對模型RNA 編輯進行生存分析。

1.3 列線圖構建 采用單因素及多因素COX 風險回歸，將上述獲得的Risk score 與患者的臨床特征（年齡、性別、臨床分期、TNM 分期）進行獨立預后分析，151個樣本因臨床數據缺失而被剔除，最終328 個樣本用于獲得肺腺癌患者獨立預后因子并構建列線圖。采用校正曲線、ROC 曲線、決策曲線檢驗該聯合模型的效能及臨床實用性。

1.4 相關性及差異分析 分析Risk score與ADAR基因表達的相關性、腫瘤組織和正常組織中選定Atire 位點編輯水平的差異、RNA 編輯與肺腺癌驅動基因（EGFR、ROS1、ALK）的相關性。

1.5 統計學方法 采用R 4.2.1 統計軟件。R 語言包有Survival、caret、glmnet、survminer、timeROC、dplyr、tidyr、CMplot、pheatmap、limma、ggpubr、regplot、rms、ggDCA、ggplot2、clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、circlize、RColorBrewer、ComplexHeatmap、reshape2、tidyverse、ggExtra。差異分析采用Wilcoxon 秩和檢驗，相關性分析采用Pearson 相關。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TCGA 數據集中LUAD 患者基線資料 見表1。

表1 TCGA數據集中LUAD患者臨床資料［n（%）］

2.2 預后模型的構建和初步檢驗 對建模組進行單變量COX 回歸分析，共發現8 個ATIRE 位點與LUAD 的OS 強相關（P＜0.001），用Lasso 回歸分析從中篩選出6個位點，進行多因素COX 分析，剩余4 個位點作為最優預后位點，ADAM19|chr5：156904952、CWF19L1|chr10：101992267、FOXK1|chr7：4809281、CPT1A|chr11：68523468。應用各位點的系數，得到ATIRE 風險評分：（ADAM19|chr5：156904952×8.46）+（CWF19L1|chr10：101992267×1.88）+（FOXK1|chr7：4809281×5.22）+（CPT1A|chr11：68523468×2.96）。4 個ATIRE 位點的風險評分和編輯水平分布在高風險組中明顯偏高，隨著風險增加生存狀態為死亡的患者增加，表明4 個位點可能均與疾病預后不良相關。高風險組的OS 在建模組（P＜0.001）、驗證組（P＜0.001）和所有患者（P=0.038）中均明顯降低。模型RNA 編輯的生存分析結果顯示，4 個RNA 編輯位點表達量與患者生存時間負相關（P＜0.01）。兩組中不同年齡、性別、分期、TNM 分期的Risk score差異分析顯示風險評分在不同臨床特征中差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1-5。

圖1 LUAD患者生存相關ATIRE位點的鑒定。A.曼哈頓圖描繪了所有ATIRE位點與LUAD生存之間的聯系，以單變量COX-PH模型中-log10尺度的P值為x軸，以ATIRE位點的染色體位置為y軸。點橙色線表示P值為0.00001的顯著性截斷。B.Lasso回歸結果；C.選擇最佳ATIRE位點（λ）和虛線垂直線的交叉驗證

圖2 ATIRE風險評分與LUAD患者預后的關系。所有患者（A）、建模組（B）和驗證組（C）4個ATIRE位點的ATIRE編輯水平、風險評分、生存狀態的分布

圖3 所有患者（A）、建模組（B）和驗證組（C）中按風險評分分組的生存概率的可視化Kaplan-Meier圖

圖4 4個ATIRE位點在高低風險組中的生存曲線

2.3 基于ATIRE 的列線圖建立及其性能預測 COX 單變量分析結果顯示，Risk score 可影響預后。多變量分析顯示，Risk score 有成為獨立預后因素的潛質。根據ATIRE 風險評分和臨床病理特征，包括年齡、性別、臨床分期、TNM 分期建立列線圖。校準圖（95% CI：0.685～0.740）顯示在1 年、2 年和3 年觀察到OS 與列線圖預測的OS 有更好的一致性。ROC 曲線和決策曲線顯示Risk（AUC=0.723）和Nomogram（AUC=0.774）大于單一臨床病理特征。表明建立的模型比單一臨床病理特征具有更高的凈效益，在預測患者OS 方面可能存在進一步研究的價值見圖6-7。

圖6 單因素（A）及多因素（B）COX回歸分析

圖7 基于ATIRE風險評分和臨床病理特征的預后列線圖的性能。A.預測LUAD患者1、2、3年OS概率的列線圖；B.校正曲線：在1年、2年和3年觀察到OS與列線圖預測的OS一致；C.決策曲線；D.ROC曲線：不同列線圖在預測1年OS的凈效益方面的比較

2.4 ATIRE 風險評分和ADAR1 基因表達相關性分析 ATIRE 風險評分和ADAR1 在TCGA-LUAD 腫瘤組織中的表達存在顯著正相關（P＜0.001）。見圖8A。

圖8 風險評分與ADAR的關系和不同組織間RNA編輯情況的差異。A.風險評分與ADAR基因表達的相關性；B-E.LUAD腫瘤組織和正常組織中選定ATIRE位點編輯水平的差異

2.5 RNA 編輯差異分析 CPT1A|chr11：68523468（P＜0.001）、FOXK1|chr7 ：4809281（P＜0.001）、ADAM19|chr5：156904952（P＜0.001）ATIRE 位點編輯水平在腫瘤組織和正常組織間差異有統計學意義。而CWF19L1|chr10：101992267 差異無統計學意義（P=0.26）。見圖8B-E。

2.6 RNA 編輯和肺腺癌驅動基因（EGFR、ROS1、ALK）表達相關性分析 RNA 編輯ADAM19|chr5：156904952與ALK 基因表達呈負相關（R=-0.13，P=0.0041）與ROS1 同樣呈負相關（R=-0.1，P=0.023）、CPT1A|chr11：68523468 與ROS1 呈負相關（R=-0.13，P=0.0045）、FOXK1|chr7：4809281 與ROS1 表達呈負相關（R=-0.11，P=0.013）、CWF19L1|chr10：101992267 與三個驅動的相關性均不顯著。見圖9。

圖9 RNA編輯和肺腺癌驅動基因（EGFR、ROS1、ALK）表達相關性 A-B.ADAM19|chr5：156904952與ALK、ROS1表達的關系；C.CPT1A|chr11：68523468與ROS1表達的關系；D.FOXK1|chr7：4809281與ROS1表達的相關性

3 討論

本研究通過COX-PH 回歸和Lasso 算法，確定了4 個與OS 相關的Atire 位點是LUAD 的最佳預后因素。RNA 編輯是一種特殊的轉錄后修飾，其使得同一個基因翻譯出功能相關但又有結構差異的蛋白。其可能與一些功能已知的基因在腫瘤的形成過程中表現出未知的行為有關。如ADAM19 基因編碼ADAM（崩解素和金屬蛋白酶結構域）家族的成員。其已被證明是一種活性金屬蛋白酶，可能參與正常的生理過程，如細胞遷移、細胞黏附、細胞間基質相互作用以及信號轉導。既往研究提示正常肺組織也存在RNA 編輯ADAM19|chr5：15690495。ADAM19 能促進部分腫瘤的生長遷移，如其在乳腺浸潤性癌（BRCA）中高表達，其上調可促進H2BE76K 細胞的集落形成能力［12］。在結直腸癌中通過siRNA 敲除ADAM19 可以抑制細胞的遷移和侵襲，miR-30c 可以通過直接靶向ADAM19 抑制癌細胞的生長、遷移和侵襲［13］。肺癌中也有關于將miR-153靶向ADAM19 抑制人非小細胞肺癌的遷移和侵襲的報道［14］。相反，在前列腺癌中，ADAM19 在腫瘤細胞中低表達，這顯示人類前列腺癌的保護性生物標志物［15］。卵巢癌中ADAM19 的表觀遺傳抑制可能有助于卵巢癌的進展［16］。

CWF19L1 基因編碼CWF19 蛋白家族成員。其可通過替代剪接產生多個轉錄本變體。該基因的突變與常染色體隱性脊髓小腦性共濟失調-17 和輕度認知障礙有關［17-18］。CWF19L1 與人類癌癥發生發展的相關性不明確，其致瘤與否及其機制有待進一步研究。

FOXK1 具有DNA 結合轉錄阻遏活性，RNA 聚合酶II 特異性和轉錄順式調控區結合活性。參與多個生物學過程，包括細胞葡萄糖穩態、自噬的負調節、轉錄的調節和DNA 模板。FOXK1 激活能促進三陰性乳腺癌的淋巴管生成和轉移［19］。FOXK1 過表達可以增強細胞遷移能力和侵襲能力［20］。敲低FOXK1 可通過抑制糖酵解抑制肝癌細胞活力［21］。高FOXK1 表達與肝細胞癌不良預后相關［22］。FOXK1 表達與肝癌患者OS 成反比［23］

CPT1A 是肉堿依賴性轉運線粒體內膜的關鍵酶，其缺乏導致脂肪酸β-氧化速率降低。其對多種癌癥的影響也是基于影響脂肪酸β-氧化實現。如miR-328-3p—CPT1A—脂肪酸在β-氧化干性軸中負責乳腺癌轉移［24］。卵巢癌中較高的脂肪酸氧化途徑表達與鉑抗性有關，且肉堿棕櫚酰轉移酶1A 的抑制使卵巢癌細胞對鉑敏感［25］。CPT1A 通過調節脂肪酸氧化抑制凋亡促進大腸癌細胞轉移［26］。前列腺癌中雄激素減少促進CPT1A 高表達腫瘤的生長［27］。

ATIRE 可能導致非同義的氨基酸突變，選擇性剪接的錯誤調節，密碼子偏好紊亂以及microRNA-mRNA重定向或RNA 結合蛋白-mRNA 重定向，從而影響基因原有功能，這導致腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和耐藥能力增強。同時，腫瘤組織中ATIRE 風險評分和ADAR1 顯著相關性，提示高風險組中RNA 編輯水平增高。深入研究如何減少腫瘤進展相關的不良編輯事件可能有助于解決腫瘤治療中的熱點問題。

此外，在LUAD 腫瘤組織和正常組織間觀察到CPT1A|chr11：6852346、FOXK1|chr7：4809281、ADAM19|chr5：15690495 的編輯水平差異有統計學意義，表明這些異常的編輯可能與LUAD 的發生發展相關。目前認為肺腺癌的驅動基因（EGFR、ALK、ROS1）突變或擴增是預后良好的預測生物標記物，而這些基因的陰性則缺少相應的靶向治療，這些患者的預后相對較差。RNA 編輯ADAM19|chr5：156904952 與ALK和ROS1 基因表達呈負相關、CPT1A|chr11：68523468與ROS1 呈負相關、FOXK1|chr7：4809281 與ROS1 表達呈負相關可能提示患者瘤內RNA 編輯水平高將影響EGFR、ALK、ROS1 的表達，從而引起不良預后。雖然兩者間的相關性仍缺乏相關報道，但其結果也表明模型在預測預后方面具有一定價值。

通常，列線圖在預測LUAD 的OS 方面具有中等精度，與預測1 年和3 年OS 的T、N、M 分期系統相比，顯示出更好的整體凈收益。盡管就有效性而言，與Harrell 的C 指數所示的基于基因表達的列線圖相比，ATIRE 的列線圖并未顯示出明顯優勢，但就測定可靠性而言，ATIRE 測定相對不易受到RNA 質量和PCR 反應的影響，這可以避免個體間和個體內的變異。

總之，本研究首次建立與LUAD 患者的OS 和臨床分期相關的ATIRE 風險評分。雖然結合ATIRE 風險評分和臨床病理特征的列線圖能用于預測LUAD 的 OS，且在理論上具有較好的效用，但這仍需要大量的真實世界研究來驗證該模型的準確性。