Box-Behnken 響應面法優選紫斑牡丹中丹皮酚和芍藥苷提取工藝*

周 坤，付永莉，羅 婷，羅 星，吳春芳

（湖北省武漢市精神衛生中心·湖北省武漢市心理醫院，湖北 武漢 430012）

紫斑牡丹Paeonia rockii（S，G.Haw et L.A.Lauener）T.Hong et J.J.Li 為毛茛科芍藥屬多年生木本植物的干燥根皮［1］，又名甘肅牡丹［2］，是僅次于中原牡丹種群的第二大品種［3］，因其花瓣基部有一明顯紫斑而得名［4］，其根皮作為藥用丹皮已被《甘肅省中藥材標準》收載［5］。紫斑牡丹具有清熱涼血、活血化瘀功效，臨床多用于熱入營血、溫毒發斑、無汗骨蒸、經閉痛經等癥［1-2］。紫斑牡丹根皮中丹皮酚和芍藥苷的含量較高，高效提取和分離丹皮酚和芍藥苷對擴大牡丹皮藥用資源和綜合利用有現實意義［6］。由于活性成分丹皮酚能隨水蒸氣蒸餾，采用蒸餾法獲得丹皮酚蒸餾母液，結合重結晶法獲取丹皮酚提取物［7］，與傳統醇提法相比，具有純化后處理簡單、無水溶性雜質干擾、提取純度更高等優勢［8］。本研究中結合紫斑牡丹中活性成分的理化特性，先采用蒸餾法提取丹皮酚［9-10］，后結合醇沉法提取芍藥苷［11-12］，以二者提取率綜合評分為響應值，通過對提取關鍵因素及相關水平的考察，優化紫斑牡丹中丹皮酚及芍藥苷的最佳提取工藝。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Starsorius BSI 型電子分析天平（天津泰斯特精密儀器有限公司，精度為萬分之一）；KQ-250E 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為50 kHz）；RE-52AA 型亞榮旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；HH-4 型數顯恒溫水浴裝置（江蘇榮華儀器制造有限公司）；CS101-AB 型電熱鼓風干燥裝置（重慶試驗設備廠）。

1.2 試藥

紫斑牡丹飲片（甘肅和順元中藥飲片有限公司，批號為2021112302）；丹皮酚對照品（批號為110708-202103，純度大于98.5%），芍藥苷對照品（批號為110736-202141，純度大于98.5%），均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈（色譜純，美國Tedia 公司）；其他試劑均為分析純，水為三重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

丹皮酚［13］179：色譜柱為Agilent Eclipse plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為甲醇-水（45∶55，V/V）；柱溫為25 ℃；流速為1.0 mL/ min；檢測波長為274 nm；進樣量為10μL。

芍藥苷［13］108：色譜柱為CAPCELL PAK-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為0.1%磷酸-乙腈溶液（14∶86，V/V）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為230 nm；進樣量為10μL。

2.1.2 溶液制備

對照品溶液：取丹皮酚、芍藥苷對照品各適量，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加甲醇分別制成每1 mL 含0.600 0 mg 丹皮酚、1.500 0 mg 芍藥苷的對照品貯備液；取對照品貯備液各適量，加甲醇稀釋成質量濃度分別為0.048，0.096，0.192，0.240，0.288μg/mL的丹皮酚對照品溶液［13］179及0.12，0.24，0.48，0.60，0.72μg/mL的芍藥苷對照品溶液［13］108。

供試品溶液：取紫斑牡丹根皮飲片50 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加液料比倍量的水，連接冷卻回流裝置，回流提取，參照2020年版《中國藥典（一部）》附錄中水蒸氣蒸餾法，收集9 倍量餾出液，4 ℃冰箱靜置12 h，傾去大部分上清液，濾過，得結晶物；合并濾液及上清液，加入其體積量5%的氯化鈉（即每100 mL 溶液加氯化鈉5 g）混勻，溶解，再進行重蒸餾，收集3 倍量的重蒸餾液，4 ℃冰箱靜置12 h，濾過，得結晶物。合并2次結晶物，40 ℃熱風干燥，得丹皮酚提取物。取丹皮酚提取物0.2 g，精密稱定，置具塞磨口錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率為300 W，頻率為50 kHz）15 min，放冷，再稱定質量，以甲醇補充減失的質量，搖勻，濾過，精密取續濾液1 mL，置25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻［13］179，即得丹皮酚供試品溶液。取上述回流提取液，趁熱濾過，合并濾液，濃縮至相對密度為1.10～1.20（60 ℃熱測），加入95%工業乙醇攪拌，靜置24 h，取上清液，濾渣再加95%工業乙醇醇沉12 h，合并2 次上清液，置旋轉蒸發儀中回收乙醇，得芍藥苷流浸膏，將流浸膏轉入蒸發皿中，以少量乙醇潤洗燒瓶，洗液轉入蒸發皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h，干燥器中放冷，即得干膏。取干膏粉0.1 g，精密稱定，置50 mL磨口錐形瓶中，加稀乙醇35 mL，超聲處理（功率為240 W，頻率為45 kHz）15 min，放冷，加稀乙醇定容，搖勻，濾過，取續濾液［13］108，即得芍藥苷供試品溶液。

2.1.3 方法學考察

系統適用性試驗：分別吸取丹皮酚對照品溶液（0.192μg/mL）、芍藥苷對照品溶液（0.48μg/mL）、供試品溶液和空白溶劑各10μL，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定。供試品溶液中，待測組分與其相鄰峰分離度均大于1.5，理論板數按丹皮酚峰和芍藥苷峰計分別大于5 000和2 000。色譜圖見圖1。

線性關系考察：精密吸取2.1.2項下丹皮酚和芍藥苷對照品溶液各10μL，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定5 次，以對照品溶液質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y丹=75.315 2X丹-0.004 7（r=0.999 9，n=5）和Y芍=95.924 7X芍-0.003 8（r=0.999 8，n=5）。結果表明，丹皮酚和芍藥苷的質量濃度分別在0.048～0.288μg/mL和0.12～0.72μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限與定量限確定：將丹皮酚和芍藥苷對照品溶液（質量濃度分別為0.192，0.48μg/mL）逐級稀釋，分別以信噪比（S/N）為3 倍和10 倍時的質量濃度為定量限和檢測限。結果丹皮酚和芍藥苷的定量限分別為0.018 7，0.023 4 μg/mL，檢測限分別為0.005 6，0.007 0μg/mL。

精密度試驗：精密量取丹皮酚和芍藥苷對照品溶液（質量濃度分別為0.192，0.48 μg/mL）各10 μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定6次，記錄峰面積。結果丹皮酚和芍藥苷峰面積的RSD分別為1.87%和1.55%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密量取2.1.2 項下供試品溶液適量，分別于0，3，6，9，12，24 h 時按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果丹皮酚和芍藥苷峰面積的RSD分別為1.94%和1.78%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取紫斑牡丹樣品（批號為2021112302），按2.1.2 項下方法制備丹皮酚和芍藥苷供試品溶液各5 份，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果丹皮酚和芍藥苷含量的RSD分別為1.97%和1.89%（n=5），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取6份已知含量的紫斑牡丹根皮飲片適量，每份0.5 g，精密稱定，向各批次飲片中分別準確加入近100%的丹皮酚和芍藥苷對照品，混勻，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定。結果丹皮酚和芍藥苷的平均加樣回收率均為99.74%，RSD分別為1.33%和1.71%（n=6），表明方法準確度良好。

2.1.4 丹皮酚含量和提取率的測定

分別精密吸取丹皮酚和芍藥苷供試品溶液各10μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，將測得峰面積（Y）代入回歸方程，計算供試品溶液的質量濃度C1（μg）［14-16］。提取物中含量（X，mg/g）、提取率（Y，%）分別按公式（1）和（2）計算。

式中，X為提取物中丹皮酚或芍藥苷含量；Y為紫斑牡丹中丹皮酚或芍藥苷提取率；C為丹皮酚或芍藥苷供試品溶液峰面積對應的質量濃度；ms0為紫斑牡丹藥材的取樣量；ms1為丹皮酚或芍藥苷提取物取樣量；ms2為丹皮酚或芍藥苷的提取物總量。

2.2 提取工藝單因素考察

液料比：取紫斑牡丹根皮飲片5 份，各50 g，置圓底燒瓶中，分別按液料比為15，20，25，30，35倍加水，固定提取時間為2 h，乙醇體積分數為55%，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，考察不同液料比對紫斑牡丹中丹皮酚、芍藥苷提取率綜合評分的影響，結果見圖2 A。可見，液料比在15～25倍范圍內時，丹皮酚、芍藥苷的提取率綜合評分值隨液料比的增加而升高；之后，丹皮酚、芍藥苷提取率綜合評分呈下降趨勢。隨著液料比的進一步增加，蒸餾液中丹皮酚被大量稀釋，在后續重結晶時提取率反而下降，導致丹皮酚、芍藥苷提取率綜合評分下降。因此，選擇液料比為25 倍作為Box-Behnken 響應面試驗液料比的中心點。

A.液料比 B.提取時間 C.乙醇體積分數圖2 單因素考察結果A.Liquid-solid ratio B.Extraction time C.Ethanol volume fractionFig.2 Results of the single-factor experiment

提取時間：取紫斑牡丹根皮飲片4 份，各50 g，置圓底燒瓶中，液料比為25 倍，乙醇體積分數為55%，提取時間考察范圍分別為1，2，3，4 h，分別按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，考察提取時間對紫斑牡丹中丹皮酚、芍藥苷提取率綜合評分的影響，結果見圖2 B。可見，提取時間在1～2 h范圍內時，丹皮酚、芍藥苷提取率綜合評分呈遞增趨勢；當提取時間超過3 h 時，丹皮酚、芍藥苷提取率綜合評分下降趨勢明顯。可能是由于提取時間增加，受熱時間過長，餾出液中丹皮酚被大量稀釋，影響了重結晶收率；藥材加熱時間過長，藥渣糊化，對芍藥苷形成吸附、包埋作用，不利于過濾操作，導致芍藥苷提取率評分下降。因此，最終選擇Box-Behnken 響應面試驗提取時間中心點為2 h。

乙醇體積分數：取紫斑牡丹根皮飲片6 份，各50 g，置圓底燒瓶中，固定液料比為25 倍，提取時間為2 h，乙醇體積分數考察范圍設置為45%，55%，65%，75%，85%，95%，分別按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，考察乙醇體積分數對紫斑牡丹中丹皮酚、芍藥苷提取率綜合評分的影響，結果見圖2 C。可見，乙醇體積分數在50%～60%時，丹皮酚、芍藥苷的提取率綜合評分隨乙醇體積分數的升高而升高；當乙醇體積分數高于60%時，丹皮酚、芍藥苷提取率綜合評分開始顯著下降，可能與芍藥苷成分的極性密切相關。因此，最終選擇Box-Behnken 響應面試驗乙醇體積分數的中心點為55%。

2.3 Box-Behnken 響應面法優化提取工藝

2.3.1 試驗設計與結果

通過對影響綜合評分的因素進行全面考察后，最終選取液料比（因素A）、提取時間（因素B）、乙醇體積分數（因素C）和提取次數4 個關鍵影響因素作為本試驗考察的自變量，鑒于提取次數為非連續型變量（不能無限賦值），該因素無法參與回歸分析，結合實際生產及文獻［14-16］，暫定提取次數為2次。據Box-Behnken中心組合原理，取因素A、因素B、因素C 3 個關鍵因素，每個因素各設定低、中、高3 個水平，依次賦值為-1，0，+1，Box-Behnken響應面試驗因素與水平見表1。按試驗組編號對應的因素與水平進行提取操作，計算各編號組中丹皮酚和芍藥苷的提取率，以提取物中丹皮酚提取率（Y1）和芍藥苷提取率（Y2）的總權重綜合評分為評價指標，采用加權評分法計算兩者總權重綜合評分，總權重綜合評分=（丹皮酚提取率/丹皮酚提取率最大值）×50+（芍藥苷提取率/芍藥苷提取率最大值）×50。結果見表2。

表1 Box-Behnken響應面試驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of the Box-Behnken test

表2 Box-Behnken響應面試驗設計與結果Tab.2 Design and results of the Box-Behnken test

2.3.2 模型擬合與方差分析

采用Design-Expert軟件對表2中的數據進行回歸分析，得因素A、因素B 和因素C 與總權重綜合評分的線性擬合回歸模型Y=95.74+14.66A+3.07B-2.36C+2.52AB-2.98AC+0.93BC-14.67A2-0.88B2-2.54C2。方差分析結果見表3。可見，建立的回歸方程模型F=960.42，P<0.000 1，表明擬合模型差異有統計學意義；失擬項P=0.770 1>0.05，差異不顯著，表明未知因素對結果干擾較小，試驗誤差小，故判斷所建立的模型預測性良好。回歸模型中變量A，B，C，AB，AC，A2，C27 項對總權重綜合評分的線性效應均較顯著（P<0.01）。回歸方程一次項中，以因素A 對因變量的總權重綜合評分影響最突出；因素B 次之，且影響均為正相關；因素C對總權重綜合評分的影響為負相關。回歸方程二次項中，以A2和C2對總權重綜合評分的影響均為負相關，其中以因素A 的影響最顯著，因素C影響次之［14-16］。

表3 方差分析結果Tab.3 Results of the analysis of variance

采用Design-Expert 軟件對表3 中的試驗結果作圖，固定某一因素，可得任意2 個因素交互作用對綜合評分影響的三維響應面及等高線圖，詳見圖3。

A.提取時間與液料比 B.液料比與乙醇體積分數 C.提取時間與乙醇體積分數圖3 各影響因素交互作用對總權重綜合評分影響的二維等高線和三維響應面圖A.Extraction time and liquid-solid ratio B.Liquid-solid ratio and ethanol volume fraction C.Extraction time and ethanol volume fractionFig.3 2D contour and 3D response surface maps of the interaction of various influencing factors on the total weight comprehensive scores

可見，因素A與因素B、因素A與因素C的三維響應面圖均為陡峭開口向下的凸面，表明在所選定考察范圍內存在響應值的最大值；因素A 與因素B、因素A 與因素C的響應值等高線圖均為圓形至橢圓形，其對應三維響應面圖為高度卷曲的曲面，表明自變量與因變量之間的函數關系并非單純的一元線性關系，故因素A、因素B、因素C 與總權重綜合評分間的線性關系采用多元線性方程描述更合理。通過Design-Expert 軟件統計數據分析，系統預測推薦的最佳參考工藝為液料比28.25 倍，提取時間147.2 min，乙醇體積分數52.1%，該條件下理論最優總權重綜合評分可達104.02，丹皮酚提取率為0.51%，芍藥苷提取率為5.42%。為方便實際操作，將該工藝參數調整為液料比28 倍，提取時間150 min，乙醇體積分數52%。

2.3.3 驗證試驗

取紫斑牡丹根皮飲片3 份，各50 g，按優選工藝進行丹皮酚、芍藥苷提取。此工藝條件下丹皮酚提取率為0.49%（RSD=1.33%，n=3），芍藥苷提取率為5.38%（RSD=1.07%，n=3），總權重綜合評分103.62，與回歸方程的預測值基本接近，驗證了該模型預測的準確性。

3 討論

正交試驗是對孤立的試驗點進行分析的一種優化多變量系統的有效試驗設計工具，能給出最佳因素水平組合，但無法找出整個區域因素最佳組合和響應值的最優值［17］。響應面法通過對響應面等值線的分析尋求最優工藝參數，將多因素試驗中因素與指標的相互關系用二次多項式擬合。該方法研究因素與響應值、因素間的交互作用，獲得的預測模型多為曲面，在試驗條件尋優過程中，可連續對各水平進行分析［18］。響應面法獲得的預測模型為曲面，線性方程為多元線性回歸，故此模型的擬合度、失擬項參數對模型預測的準確性有較高要求，否則模型會失去其預測意義，導致系統給出的預測值出現較大偏差；響應面設計無法對試驗的非連續型變量（如提取次數）進行考察，通常需單獨考察；響應面優化系統給出的工藝參數是理論基礎上的，參數往往需結合生產實際加以修正，并對其進行工藝驗證。

本研究中通過單因素試驗獲取響應面試驗關鍵因素的中心點，在確立相應中心點基礎上，采用Box-Behnken 響應面法優化紫斑牡丹中丹皮酚和芍藥苷提取工藝。通過線性擬合模型發現，一次項中液料比與總權重綜合評分呈正相關，且液料比影響最大；乙醇體積分數對總權重綜合評分的影響為負相關，提示乙醇體積分數并非越大越好。當乙醇體積分數超過57.5%時，總權重綜合評分降至70，為維持較好的芍藥苷提取率，故乙醇體積分數應嚴格控制在50%～53%。二次項中，盡管A2，C2與總權重綜合評分呈負相關，但兩者的線性效應均高度顯著（P<0.01），其中以液料比的影響最大，提取時間次之，提示液料比是提取過程中應重點監控的因素，液料比過大，丹皮酚蒸餾液體積過大，影響重結晶效率；液料比過小，蒸餾液提取不完全。三維響應面圖顯示，交互項中液料比和提取時間對總權重綜合評分有較大影響。本研究結果顯示，乙醇體積分數為52%時對芍藥苷有良好的選擇性，考慮到實際操作需要，在合理范圍內對液料比和提取時間進行適當調整，最終優選紫斑牡丹中丹皮酚和芍藥苷提取工藝為液料比28倍，提取時間150 min，乙醇體積分數52%。