國產(chǎn)艾司唑侖原料藥及其片劑關鍵質(zhì)量屬性研究進展*

沈丹丹，胡振晶，曾令高，唐 華△

（1.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院·國家藥品監(jiān)督管理局麻醉精神藥品質(zhì)量監(jiān)測重點實驗室，重慶 401121；2.重慶大學生物工程學院，重慶 400044）

1 產(chǎn)品關鍵質(zhì)量指標

1.1 國產(chǎn)艾司唑侖原料藥合成工藝

國產(chǎn)艾司唑侖原料藥合成工藝主要包括2條路線，均以2-氨基-5-氯-二苯甲酮為起始物料，經(jīng)過一系列反應制得艾司唑侖粗品，再經(jīng)精制結(jié)晶得到成品，2 條合成路線主要差異為艾司唑侖母環(huán)結(jié)構(gòu)中三氮唑環(huán)與苯并二氮雜環(huán)的環(huán)合順序不同。由2 條合成路線可知，艾司唑侖原料藥引入的起始物料、中間體及反應副產(chǎn)物較多，且涉及的部分反應試劑為基因毒性雜質(zhì)，故雜質(zhì)譜是影響本品安全性的關鍵質(zhì)量屬性指標。

艾司唑侖粗品合成工藝路線1：以2-氨基-5-氯-二苯甲酮為起始物料，經(jīng)甲脒反應制得甲脒物（3-氨基物），再經(jīng)肼化反應生成酰肼，酰肼通過酰化反應得艾司唑侖?；铮纫阴０被榷酵?，再經(jīng)重排得二苯酮，成鹽后與烏洛托品環(huán)合制得艾司唑侖粗品。詳見圖1 A。有2家生產(chǎn)企業(yè)分別以中間體甲脒物（3-氨基物）和艾司唑侖?；铮纫阴０被榷酵┳鳛槠鹗嘉锪?，再經(jīng)路線1的酰化反應、環(huán)合反應制得艾司唑侖粗品。

A.路線1 B.路線2圖1 艾司唑侖粗品合成工藝A.Route 1 B.Route 2Fig.1 Synthesis process of estazolam

艾司唑侖粗品合成工藝路線2：以2-氨基-5-氯-二苯甲酮為起始物料，經(jīng)?；磻频冒具騺鲺；铮纫阴０被榷酵?，通過與烏洛托品環(huán)合反應生成艾司唑侖環(huán)合物（去甲西泮），再與五硫化二磷硫化反應生成艾司唑侖硫化物，最后通過與甲酰肼反應制得艾司唑侖粗品。詳見圖1 B。

1.2 國產(chǎn)艾司唑侖片處方工藝

目前，上市銷售的艾司唑侖片均為素片，均采用濕法制粒工藝制備。通過一致性評價的4家生產(chǎn)企業(yè)的處方組成與參比制劑基本一致，原料藥均控制了粒度，但限度要求不同，輔料主要為玉米淀粉（填充劑）、羥丙纖維素（崩解劑）、硬脂酸鎂（潤滑劑）、乳糖水合物（填充劑），僅1 家生產(chǎn)企業(yè)處方中黏合劑為低取代羥丙纖維素；未通過一致性評價的生產(chǎn)企業(yè)處方組成差異較大，部分生產(chǎn)企業(yè)對原料藥進行了粉碎，但均無粒度控制要求，輔料中填充劑、黏合劑、崩解劑種類和用量不同，有4家生產(chǎn)企業(yè)使用乙醇作為潤濕劑。本品生產(chǎn)工藝較簡單，規(guī)格小，輔料占比高，工藝過程控制可能對產(chǎn)品含量均勻度有顯著影響。可見，含量均勻度、溶出度及含量測定是影響本品有效性及均一性的關鍵質(zhì)量屬性指標。

1.3 產(chǎn)品質(zhì)量風險評估

根據(jù)原料藥合成工藝及制劑處方工藝，結(jié)合艾司唑侖原料藥及其片劑最新國內(nèi)外質(zhì)量標準收載情況，對質(zhì)量指標進行風險分析，確定影響產(chǎn)品安全性、有效性及均一性的關鍵質(zhì)量屬性指標。詳見表1。

表1 艾司唑侖原料藥和片劑關鍵質(zhì)量屬性指標的風險評估Tab.1 Risk assessment of critical quality attribute indicators of estazolam API and Estazolam Tablets

2 關鍵質(zhì)量屬性指標控制方法

2.1 安全性

2.1.1 有關物質(zhì)

根據(jù)國內(nèi)艾司唑侖原料藥合成工藝，粗品合成路線最長的為6步反應，最短的為2步反應。共涉及3個起始物料，包括2-氨基-5-氯-二苯甲酮、甲脒物（3-氨基物）和艾司唑侖?；铮纫阴０被榷酵?，其中甲脒物和艾司唑侖酰化物又為中間體，根據(jù)起始物料、中間體、反應副產(chǎn)物、降解產(chǎn)物等共推導出11 個雜質(zhì)。詳見表2。

表2 根據(jù)原料藥合成工藝推導的艾司唑侖雜質(zhì)譜Tab.2 Impurity spectrum of estazolam derived from the synthesis process of estazolam API

除JP18及《日本藥典外藥品標準（第三部）》有關物質(zhì)采用薄層色譜法外，其余質(zhì)量標準均采用高效液相色譜（HPLC）法。艾司唑侖原料藥有關物質(zhì)控制情況：1）ChP2020（二部）艾司唑侖原料藥及其片劑有關物質(zhì)采用不加校正因子的自身對照法計算，色譜條件一致，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為甲醇-水（65∶35，V/V），檢測波長為223 nm，供試品溶液質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，原料控制總雜質(zhì)限度為0.5%，片劑控制總雜質(zhì)限度為1.0%，缺失已知雜質(zhì)控制。2）USP2022 原料藥有關物質(zhì)采用加校正因子的主成分外標法計算，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為乙腈-水（梯度洗脫），檢測波長為254 nm，供試品溶液質(zhì)量濃度為1 mg/mL，控制了5個已知雜質(zhì)，限度均為0.1%，未知單個雜質(zhì)的限度為0.10%，總雜質(zhì)限度為0.5%。

艾司唑侖片有關物質(zhì)控制情況：1）USP2022艾司唑侖片有關物質(zhì)采用峰面積歸一化法計算，以苯基硅烷鍵合硅膠為填充劑（150 mm×4.6 cm，3μm），以質(zhì)量濃度為2.8 g/L 的磷酸二氫鉀溶液（用1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)pH至6.5）-甲醇-乙腈（55∶35∶10，V/V/V）為流動相，檢測波長為254 nm，供試品溶液質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL，單個雜質(zhì)和總雜質(zhì)限度分別為0.5%和1.0%。2）艾司唑侖片一致性評價后的質(zhì)量標準如下，YBH03582022有關物質(zhì)色譜條件與ChP2020基本一致，僅檢測波長為254 nm；YBH06222021 和YBH08682021與USP2022 艾司唑侖片色譜條件一致；YBH09462021質(zhì)量標準流動相與USP2022 艾司唑侖片一致，但采用梯度洗脫，雜質(zhì)控制最嚴格，5 個已知雜質(zhì)、單個雜質(zhì)、總雜質(zhì)限度分別為0.2%，0.2%，1.0%?？梢?，各標準有關物質(zhì)色譜條件、供試品溶液質(zhì)量濃度的差異可能導致雜質(zhì)檢測能力和分離能力不同。

范鋼［19］對艾司唑侖中間體合成工藝及有關物質(zhì)結(jié)構(gòu)確證進行研究，對1 個艾司唑侖中間體及6 個有關物質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行解析，但并未對這7個雜質(zhì)的控制方法進行研究。且目前未見其他文獻報道艾司唑侖引入的10個相關雜質(zhì)的全面控制方法，通過對比各標準色譜條件，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量標準YBH09462021 能有效分離8 種雜質(zhì)，而其他標準均存在雜質(zhì)共同洗脫的問題。

2.1.2 基因毒性雜質(zhì)

根據(jù)艾司唑侖原料藥合成工藝，2-氨基-5-氯-二苯甲酮的起始物料為對氯硝基苯，環(huán)合反應使用的試劑烏洛托品的起始物料為甲醛，還使用了甲酰肼、氯乙酰氯等含有警示結(jié)構(gòu)的基因毒性雜質(zhì)作為反應試劑，通過全面考慮起始物料、試劑、溶劑和副產(chǎn)物等可能引入的基因毒性雜質(zhì)，累積評估8 個基因毒性雜質(zhì)（表3）。對于無毒理學數(shù)據(jù)的基因毒性雜質(zhì)，按允許暴露量（PDE）為1.5 μg/d，艾司唑侖每日最大服用劑量為12 mg，限度計算為125×10-6。本品基因毒性雜質(zhì)種類多、結(jié)構(gòu)差異大，且多數(shù)雜質(zhì)缺乏檢測響應結(jié)構(gòu)，對分析儀器的靈敏度、準確度和選擇性要求較高。雖然目前國內(nèi)外未見相關文獻報道艾司唑侖原料藥中基因毒性雜質(zhì)含量的研究，但有較多文獻報道了藥物中甲酰肼、氯乙酰氯、氯乙酸、N-亞硝胺類等基因毒性雜質(zhì)的研究［23-31］。故以此建立了測定艾司唑侖原料藥中甲醛含量的HPLC衍生法，發(fā)現(xiàn)1家生產(chǎn)企業(yè)的2批原料藥中甲醛含量達60×10-6，遠超過控制閾值的33×10-6（30%限度濃度），建議生產(chǎn)企業(yè)將甲醛納入質(zhì)量標準，并依據(jù)多批次原料積累數(shù)據(jù)，制訂合理的控制策略。

表3 艾司唑侖原料藥基因毒性雜質(zhì)Tab.3 Genotoxic impurities of estazolam API

2.1.3 殘留溶劑

艾司唑侖原料藥合成工藝中使用了12 種有機溶劑，包括環(huán)己烷、乙醇、乙腈、正丁醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、三乙胺、二氯乙烷、二甲基甲酰胺、冰醋酸、苯。其中，1 類溶劑5 種，2 類溶劑2 種，3 類溶劑5 種。同時，艾司唑侖片未通過一致性評價的4家生產(chǎn)企業(yè)制粒工藝均使用乙醇作為潤濕劑。前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，4 家生產(chǎn)企業(yè)均未考察乙醇殘留量。ChP2020艾司唑侖原料藥中未規(guī)定需要檢測的殘留溶劑種類及方法，4 個原料藥生產(chǎn)企業(yè)所用殘留溶劑不同，限定殘留溶劑種類的方法可能不具有通用性。USP2022 與《歐洲藥典11.2 版》（EP11.2）對殘留溶劑的控制方法相似，通則中提供的方法對殘留溶劑采用分類控制的策略，將供試品中的殘留溶劑按1 類、2 類、3 類殘留溶劑分別進行控制。參考ChP2020（四部）通則0861 殘留溶劑項下方法，分別采用極性色譜柱HP-INNOWAX 柱（30 m × 0.32 μm，0.5 μm）和非極性色譜柱DB-1 柱（30 m × 250 μm，0.5μm），以丁酮為參比溶劑，用程序升溫方法，測定艾司唑侖原料藥及其片劑中殘留溶劑的保留時間。結(jié)果2 家生產(chǎn)企業(yè)的艾司唑侖片中檢出與乙醇校正相對保留時間（RART）一致的色譜峰，并建立乙醇定量測定方法，結(jié)果8批樣品中的乙醇含量為0.4%～0.5%。

2.2 有效性

2.2.1 溶出度

艾司唑侖屬基于藥物體內(nèi)分布的生物藥劑學分類系統(tǒng)（BDDCS）2 類藥物，即低溶解性強代謝性藥物。伏圣青［32］采用Caco-2 體外細胞模型對艾司唑侖的滲透性進行了研究，認為艾司唑侖屬生物藥劑學分類系統(tǒng)（BCS）1類藥物，即高溶解性高滲透性藥物，推測主要是考慮到艾司唑侖的劑量規(guī)格，故BDDCS 與BCS 分類不同。雖然各標準溶出度限度均為標示量的80%，但ChP2020 溶出度條件與其他標準差異顯著。ChP2020中，艾司唑侖片溶出條件采用第三法（小杯法），轉(zhuǎn)速為100 r/min，溶出介質(zhì)為鹽酸溶液（9→1 000）100 mL（1 mg 規(guī)格）或200 mL（2 mg 規(guī)格），取樣時間為30 min，樣品在此條件下溶出較劇烈，不能有效評價制劑的溶出情況；采用紫外光譜（UV）吸收系數(shù)法測定溶出量，存在專屬性不高的問題。一致性評價后，質(zhì)量標準中溶出度與USP2022及《日本藥典外藥品標準（第三部）》一致，均采用槳法，溶出介質(zhì)為水900 mL，轉(zhuǎn)速為50 r/min，時間為30 min，采用HPLC 對照品外標法測定溶出量。伏圣青等［33］采用槳法進行溶出度試驗，并建立了靈敏度更高的HPLC 外標法，可反映不同生產(chǎn)企業(yè)不同批次間艾司唑侖片溶出行為的差異，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)艾司唑侖片與參比制劑在溶出介質(zhì)水中溶出行為差異較大。參照日本橙皮書收載的艾司唑侖片溶出曲線條件，發(fā)現(xiàn)通過一致性評價的4 家生產(chǎn)企業(yè)的艾司唑侖片的溶出行為與參比制劑一致，在4 種溶出介質(zhì)中，15 min 時累積溶出量達85%，為快速溶出制劑。通過一致性評價的7家生產(chǎn)企業(yè)的艾司唑侖片15 min 時累積溶出量未達到85%，且與參比制劑溶出曲線計算的相對校正因子（f2）值均小于50，未滿足快速溶出要求，這進一步說明現(xiàn)行標準ChP2020溶出條件區(qū)分力弱。

2.2.2 含量均勻度及含量測定

艾司唑侖片現(xiàn)行標準ChP2020 含量均勻度及含量測定采用UV 吸收系數(shù)法，文獻［34］報道該方法受操作過程、儀器等因素影響較大，易造成測定結(jié)果的偏差。另外，楊惠霞等［35］采用紫外分光光度法測定艾司唑侖含量，發(fā)現(xiàn)片劑輔料于268 nm 波長下有紫外吸收，結(jié)果相對偏高，同時采用HPLC 法測定艾司唑侖含量，結(jié)果更準確。一致性評價后，質(zhì)量標準及USP2022 均采用HPLC 法進行含量測定，雖然色譜條件各不相同，但提示HPLC 法能更準確地測定艾司唑侖含量。USP2022 艾司唑侖片與注冊標準YBH08682021 和YBH06222021的色譜條件相同，均采用HPLC 外標法（等度洗脫），色譜柱采用填料L11柱（150 mm×4.6 mm，3μm），流動相為質(zhì)量濃度為2.8 g/L 的磷酸二氫鉀溶液（用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH 至6.5）-甲醇-乙腈（55∶35∶10，V/V/V），檢測波長為254 nm，供試品溶液質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL。質(zhì)量標準YBH03582022 中的色譜條件同其有關物質(zhì)的色譜條件。注冊標準YBH09462021 中的色譜柱為C18柱，流動相為乙腈-水（40∶60，V/V），檢測波長為223 nm，供試品與對照品溶液質(zhì)量濃度均為10μg/mL。參照注冊標準YBH09462021的色譜條件，建立測定艾司唑侖片含量的HPLC 法，發(fā)現(xiàn)未通過一致性評價產(chǎn)品UV 吸收系數(shù)法含量測定結(jié)果普遍高于HPLC法，2 種方法含量最大差值近10%?？梢姡茌o料及濾過方式的影響，會導致UV吸收系數(shù)法測定結(jié)果偏高。

3 問題與展望

目前，關于第二類精神藥品艾司唑侖研究的國內(nèi)外文獻大多基于臨床使用數(shù)據(jù)，而質(zhì)量評價的報道較少。本研究中通過比較艾司唑侖原料藥及其片劑國內(nèi)外質(zhì)量標準中關鍵質(zhì)量屬性指標控制差異，結(jié)合國產(chǎn)艾司唑侖原料藥及其片劑生產(chǎn)工藝特點，發(fā)現(xiàn)目前國內(nèi)艾司唑侖原料藥及其片劑質(zhì)量標準中存在可能引起安全性、有效性及均一性的風險。艾司唑侖原料藥現(xiàn)行標準ChP2020主要存在有關物質(zhì)缺失特定雜質(zhì)控制、限度設置不合理的問題。國內(nèi)原料藥生產(chǎn)企業(yè)應結(jié)合自身合成工藝，開展基因毒性雜質(zhì)與殘留溶劑研究，基于風險評估制訂合理控制策略，降低藥物安全性風險。艾司唑侖制劑在溶出度、含量均勻度、含量測定等有效性方面，測定方法缺乏科學性；在有關物質(zhì)控制方面，雜質(zhì)控制及限度設置缺乏合理性，可能無法反映國產(chǎn)艾司唑侖片的質(zhì)量差異。通過對比發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)艾司唑侖片通過一致性評價的注冊標準整體提升，更有利于產(chǎn)品質(zhì)量控制，但工藝雜質(zhì)限度設置不合理。建議尚未通過一致性評價的生產(chǎn)企業(yè)在開展本品種質(zhì)量研究時應重點關注有關物質(zhì)、雜質(zhì)譜、基因毒性雜質(zhì)、溶出度、含量均勻度、含量測定等關鍵質(zhì)量屬性指標，優(yōu)化產(chǎn)品處方及工藝設計，提高產(chǎn)品質(zhì)量。同時，建議修訂ChP2020艾司唑侖原料藥及其片劑的質(zhì)量標準，以滿足已上市藥品質(zhì)量監(jiān)管的需求，保障用藥的安全性和有效性。