高效液相色譜法測定枸櫞酸芬太尼注射液有關物質含量*

宋文濤，曾令高，高梓真，王佳瑜，馮 旭，許向陽△

（1.江蘇恩華藥業股份有限公司藥物研究院·江蘇省中樞神經藥物研究重點實驗室，江蘇 徐州 221000；2.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院·國家藥品監督管理局麻醉精神藥品質量監測重點實驗室，重慶 401121）

枸櫞酸芬太尼注射液為強效鎮痛藥，適用于麻醉前、中、后期的鎮靜與鎮痛，是目前復合全身麻醉中的常用藥物，臨床用法為靜脈注射、硬膜外給藥及靜脈滴注［1-8］，其風險遠高于口服、肌肉注射等給藥方式［9-10］，故應嚴格控制產品質量。枸櫞酸芬太尼注射液法定質量標準有《中國藥典》（ChP）［11］、《美國藥典》（USP）［12］和《英國藥典》（BP）［13］，但USP 中未對有關物質進行控制，ChP 中僅控制1 個特定雜質（雜質Ⅰ），BP 中控制2個特定雜質（雜質Ⅰ和雜質Ⅱ）。為進一步明確枸櫞酸芬太尼注射液的潛在雜質，保證用藥安全，本研究中建立了測定枸櫞酸芬太尼注射液有關物質含量的高效液相色譜（HPLC）法，并進行了方法學驗證，旨在提升現有枸櫞酸芬太尼注射液的質量標準。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；LC-20AD 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；ME403T型電子分析天平（精度為1 mg），XSE205型電子分析天平（精度為10μg），XP6型電子分析天平（精度為1 μg），Seven Excellence 型多參數測定儀，均購自瑞士Mettler Toledo 公司；SHH-200GD-2 型藥物強光照射試驗箱（重慶永生實驗儀器廠）；DGG-9030B型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）。

1.2 試藥

枸櫞酸芬太尼對照品（批號為171204-201905，含量為99.9%），雜質Ⅰ對照品（批號為171268-201602，含量為100.0%），均購自中國食品藥品檢定研究院；雜質Ⅱ對照品（批號為W986640，含量為99.6%），雜質Ⅲ對照品（批號為1030988，含量為98.8%），均購自英國LGC公司；雜質Ⅺ（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為D1912161，含量為99.107%）；枸櫞酸芬太尼注射液（江蘇恩華藥業股份有限公司，規格為每支10 mL∶0.5 mg，批號分別為ZA20211201，ZA20211202，ZA20 211203；規格為每支2 mL∶0.1 mg，批號分別為ZB20211201，ZB20211202，ZB20211203）；枸櫞酸、氯化銨均為分析純，乙腈、甲醇均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack scepter C18-120 柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：A 為0.01 mol/L 氯化銨溶液-乙腈（950∶50，V/V），B 為0.01 mol/L 氯化銨溶液-乙腈（400∶600，V/V），梯度洗脫（0～7 min時30%B →40%B，7～25 min 時40%B →100%B，25～40 min 時100%B，40～45 min 時100%B →30%B，45～60 min 時30%B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：100μL。

2.2 溶液制備

空白溶液：取枸櫞酸適量，加水溶解并定量稀釋成每1 mL約含枸櫞酸0.028 mg的溶液。

對照品溶液：取雜質Ⅰ、雜質Ⅱ、雜質Ⅲ和雜質Ⅺ對照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解，用水稀釋成每1 mL約含各雜質5μg的溶液，即得對照品貯備液；取對照品貯備液適量，加水溶解，稀釋成每1 mL約含各雜質0.25μg的溶液，即得。

系統適用性溶液：分別取枸櫞酸芬太尼對照品和對照品貯備液各適量，加水溶解，稀釋成每1 mL約含芬太尼50μg、各雜質0.25μg的溶液，即得。

供試品溶液：取枸櫞酸芬太尼注射液適量，直接作為供試品溶液。

加樣供試品溶液：取對照品貯備液0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加供試品溶液定容，搖勻，即得

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：取2.2 項下系統適用性溶液適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果芬太尼及各特定雜質的色譜峰均能達到基線分離，分離良好。詳見圖1。

1.雜質Ⅲ 2.雜質Ⅺ 3.雜質Ⅱ 4.芬太尼 5.雜質Ⅰ圖1 系統適用性試驗高效液相色譜圖1.Impurity Ⅲ 2.Impurity Ⅺ 3.Impurity Ⅱ 4.Fentanyl 5.Impurity ⅠFig.1 HPLC chromatogram of the system suitability test

破壞性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別在酸（3 mol/L 鹽酸溶液破壞24 h）、堿（3 mol/L 氫氧化鈉溶液破壞24 h）、氧化（10%過氧化氫溶液破壞60 min）、高溫（105 ℃破壞24 h）、光照［光照強度（5 000±500）lx，紫外光強度90μW/cm2，24 h］條件下進行破壞性試驗，取破壞后的供試品溶液和未破壞的供試品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，破壞后的供試品溶液延長有機相比例最大洗脫時間段，運行時間延長至90 min，結果見圖2。可見，擬訂的有關物質測定方法對枸櫞酸芬太尼注射液強制降解產生的雜質均可有效分離；氧化破壞條件下，雜質Ⅱ增加；酸破壞條件下，雜質Ⅰ略有增加；光照破壞條件下，在22～30 min 時會產生系列未知雜質，為芬太尼的體內代謝產物，故按非特定雜質進行控制。

1.未破壞 2.酸破壞 3.堿破壞 4.氧化破壞 5.高溫破壞 6.光照破壞圖2 破壞性試驗高效液相色譜圖1.No destroying 2.Destroyed by acid 3.Destroyed by alkali 4.Destroyed by oxidation 5.Destroyed by high temperature 6.Destroyed by lightFig.2 HPLC chromatogram of the destructive test

線性關系考察：取枸櫞酸芬太尼對照品和各雜質對照品各適量，精密稱定，按2.2 項下方法制備系列濃度的標準曲線溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以各成分質量濃度（C，μg/mL）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標進行線性回歸，并以主成分線性方程的斜率除以各雜質線性方程的斜率計算校正因子。結果見表1。

表1 線性關系考察、校正因子、檢測限及定量限確定結果Tab.1 Results of the linear relation test，correction factor，LOD and LOQ

檢測限與定量限確定：精密量取2.2項下對照品溶液適量，用水逐級稀釋，以各雜質信噪比（S/N）≥3 時的樣品量為檢測限，以S/N≥10 且連續6 次進樣峰面積的RSD≤10%時的樣品量為定量限。結果見表1。

重復性試驗：取2.2 項下加樣供試品溶液6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果各雜質的RSD均小于2.0%（n=6），表明方法重復性良好。

中間精密度試驗：精密量取2.2項下對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件，由不同試驗人員在不同日期采用不同品牌的高效液相色譜儀進樣檢測。結果各雜質的RSD均小于3.0%（n=12），表明方法中間精密度良好。

穩定性試驗：精密量取2.2項下供試品溶液與對照品溶液各適量，分別于室溫下放置0，9，18，27，36，48，60，72 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果供試品溶液與對照品溶液中各雜質及主峰面積的RSD均小于1.0%（n=8），表明供試品溶液與對照品溶液在室溫下放置72 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：精密量取2.2 項下對照品貯備液0.25，0.50，0.75 mL，置20 mL容量瓶中，加供試品溶液定容，分別作為50%，100%，150%濃度水平的加樣回收試驗溶液，平行3份，按2.1項下色譜條件進樣測定。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

耐用性試驗：取2.2 項下系統適用性溶液、對照品溶液、加樣供試品溶液各適量，分別在不同檢測波長（208，210，212 nm）、柱溫（38，40，42 ℃）、流速（0.9，1.0，1.1 mL/ min）、流動相鹽溶液pH（9.4，9.6，9.8）、流動相比例及不同批次色譜柱條件下進樣測定。結果不同條件下，主峰及各雜質的分離度均大于1.5，且有關物質含量無明顯差異，表明方法耐用性較好。

2.4 樣品有關物質含量測定

取樣品（規格為每支10 mL∶0.5 mg，批號分別為ZA20211201，ZA20211202，ZA20 211203；規格為每支2 mL∶0.1 mg，批號分別為ZB20211201，ZB20211202，ZB20211203），按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定。按外標法以峰面積計算雜質Ⅺ含量，按外標法以對照品溶液中芬太尼校正后峰面積（分別乘以各雜質的校正因子）計算雜質Ⅰ、雜質Ⅱ及雜質Ⅲ的含量。結果6批樣品中各特定雜質及未知雜質含量均小于0.05%（忽略限）。

2.5 方法驗證

取2.2 項下系統適用性溶液，分別按2.1 項下色譜條件、ChP 色譜條件［11］、BP 色譜條件［13］進樣測定。結果ChP 色譜條件下，雜質Ⅲ在溶劑峰位置出峰，且雜質Ⅰ與雜質Ⅱ未達到基線分離，色譜圖見圖3 A；BP 色譜條件下，雜質Ⅰ與雜質Ⅺ未達到基線分離，色譜圖見圖3 B。按2.1項下色譜條件進樣測定，主峰及各雜質峰分離度均大于1.5，分離良好。

1.雜質Ⅲ 2.雜質Ⅺ 3.雜質Ⅱ 4.雜質Ⅰ 5.芬太尼 6.雜質Ⅰ和雜質ⅪA.ChP法 B.BP法圖3 方法驗證試驗高效液相色譜圖1.Impurity Ⅲ 2.Impurity Ⅺ 3.Impurity Ⅱ 4.Impurity Ⅰ 5.Fentanil 6.Impurity Ⅰ and impurity ⅪA.ChP method B.BP methodFig.3 HPLC chromatogram of the method validation test

3 討論

3.1 制劑雜質譜分析

雜質Ⅰ［N-（1-苯乙基-4-哌啶基）苯胺］為枸櫞酸芬太尼合成的中間體Ⅱ，ChP 標準及BP 標準均將其作為已知雜質進行控制；雜質Ⅱ（芬太尼氮氧化物）在氧化破壞條件下檢出，為降解雜質；雜質Ⅲ（N-苯基-N-4-哌啶基丙酰胺）來源于枸櫞酸芬太尼中間體Ⅱ的合成過程，中間體Ⅰ中殘留的雜質哌啶酮和苯胺反應生成N-苯基哌啶-4-胺，在后續反應中和丙酸酐反應生成雜質Ⅲ，樣品在光照破壞條件下亦略有檢出；雜質Ⅺ（N-苯基丙酰胺）為枸櫞酸芬太尼中間體Ⅱ中殘留的苯胺和丙酸酐反應生成的產物，亦可由枸櫞酸芬太尼降解產生。綜合分析各雜質的來源及枸櫞酸芬太尼注射液后續穩定性試驗檢出情況，最終將雜質Ⅰ、雜質Ⅱ和雜質Ⅺ作為特定雜質納入枸櫞酸芬太尼注射液的質量控制標準。

3.2 雜質限度確定

ChP 標準控制1 個特定雜質（雜質Ⅰ），限度為標示量的0.5%，最大未知雜質不得過0.25%，總未知雜質不得過0.75%；BP標準控制2個特定雜質（雜質Ⅰ和雜質Ⅱ），限度均為標示量的0.5%，最大未知雜質不得過0.25%，總未知雜質不得過0.75%。按各國藥典標準中有關物質標準從嚴制訂標準限度，結合2020 年版《中國藥典（四部）》9101 分析方法驗證指導原則［14］、人用藥品技術要求國際協調理事會（ICH）Q3B R2 新藥制劑中雜質［15］的要求，規定本品含雜質Ⅰ、雜質Ⅱ和雜質Ⅺ不得過標示量的0.5%，最大未知雜質不得過0.2%，總未知雜質不得過0.75%。

3.3 方法評價

本研究中建立的方法操作簡便，專屬性強，靈敏度、耐用性好，準確度、精密度較高，可用于枸櫞酸芬太尼注射液中有關物質的含量測定。